抗纤益心方对扩张型心肌病大鼠心肌细胞PKA/CaMKⅡ信号通路及线粒体膜电位的影响

目的通过抗纤益心方干预扩张型心肌病大鼠,探讨该药在扩张型心肌病心肌细胞PKA/CaMKⅡ信号通路及线粒体膜电位方面的作用。方法扩张型心肌病大鼠通过饮用呋喃唑酮复制,连续10周后通过心脏彩超确定模型复制成功,随机分为抗纤益心方低剂量组、抗纤益心方中剂量组、抗纤益心方高剂量组、卡托普利组和模型组,另设正常组。药物干预4周后观察各组大鼠心肌细胞超微结构;心肌细胞ATP、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活力;心肌细胞CaMKⅡ、PKA、UCP2 mRNA表达。用去甲肾上腺素诱导H9c2心肌细胞肥大模型,药物干预24 h后检测心肌细胞线粒体膜电位水平。结果与正常组相比,各模型组大鼠心肌细胞线粒体受损,心肌细胞ATP、Ca^(2+)-Mg^(2+)-ATP酶活力明显降低,UCP2 mRNA、CaMKⅡmRNA均明显升高,PKA mRNA明显降低,心肌线粒体膜电位水平明显下降(P<0.05或P<0.01)。各药物干预组对心肌细胞线粒体有不同程度的保护作用,对所测指标有不同程度的改善,尤其以抗纤益心方高剂量组更为明显(P<0.05或P<0.01)。结论抗纤益心方可以减轻DCM模型大鼠心肌细胞线粒体损伤,改善心肌细胞能量代谢及舒缩功能,改善心肌细胞PKA/CaMKⅡ信号通路及线粒体膜电位水平是其机制之一。

氰戊菊酯过度激活Ca^(2+)/CaM/CaMKⅡ信号通路诱发线粒体损伤干扰TM3细胞睾酮合成

目的利用胞内Ca^(2+)螯合剂BAPTA-AM和CaM阻断剂TFP探讨Ca^(2+)/CaM/CaMKⅡ信号通路在氰戊菊酯(Fen)诱发小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞)线粒体损伤和睾酮合成障碍中的作用。方法TM3细胞实验分为对照组、Fen暴露组(25μmol/L Fen)、Fen+BAPTA-AM组(25μmol/L Fen+5 mmol/L BAPTA-AM)、Fen+TFP组(25μmol/L Fen+10μmol/L TFP),Fen暴露时长为24 h。采用ELISA法检测TM3细胞的睾酮和环磷酸腺苷(cAMP)水平,化学比色法检测TM3细胞的ATP水平,Flou-4/AM探针测定细胞内Ca^(2+)水平,JC-1染色法测定TM3细胞的线粒体膜电位(MMP)改变,蛋白免疫印迹法检测CYP11A1、3β-HSD、StAR、CaM、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、Bax和Bcl-2的蛋白表达水平。结果Fen暴露组TM3细胞的T、ATP和cAMP含量下降,MMP水平降低,睾酮合成的相关蛋白和酶CYP11A1、3β-HSD、StAR表达减少(P<0.01);同时,TM3细胞胞内的Ca^(2+)水平显著上升(P<0.01),CaM、p-CaMKⅡ/CaMKⅡ、Bax蛋白表达升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达下降(P<0.01)。Fen+BAPTA-AM组和Fen+TFP组TM3细胞的睾酮、ATP和cAMP含量上升,MMP水平升高(P<0.01),睾酮合成相关的蛋白和酶CYP11A1、3β-HSD、StAR表达增加(P<0.01),CaM、p-CaMKⅡ/CaMKⅡ及Bax蛋白表达下降,Bcl-2蛋白表达增加(P<0.01)。结论Fen诱发的TM3细胞mPTP开放以及睾酮合成障碍可能与Fen暴露后TM3细胞胞内Ca^(2+)超载、CaM和p-CaMKⅡ表达上调引起的Ca^(2+)/CaM/CaMKⅡ信号通路过度激活有关。

RIP3/CaMKⅡ信号通路对重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响

目的:观察RIP3/CaMKⅡ信号通路对柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响,并探讨CaMKⅡ特异性抑制剂KN-93对心肌损伤的作用。方法:将60只雄性BALB/c小鼠分为正常对照组、CVB3组、CVB3+KN-93组和CVB3+KN-93+Ti(活性氧簇特异性抑制剂)组,以上小鼠腹腔及尾静脉注射药物连续7 d。采用双抗体夹心免疫法检测小鼠心肌细胞坏死标志物,心脏超声技术检测小鼠心脏结构和功能,绘制Kaplan-Meier生存曲线,观察KN-93对小鼠心肌的保护作用。结果:CVB3+KN-93组小鼠心肌细胞坏死较CVB3组显著减轻,心脏功能和生存曲线改善(P<0.01);CVB3+KN-93组小鼠心肌组织H2O2含量较CVB3组显著下降(P<0.01);加入Ti后,CVB3+KN-93+Ti组H2O2含量较CVB3+KN-93组轻度下降(P<0.05),但无论是心脏功能还是生存曲线均无显著差异。结论:RIP3/CaMKⅡ信号通路在CVB3诱导的急性重症病毒性心肌炎小鼠心肌细胞损伤中起到主导作用;KN-93能阻断这种作用并可能产生新的治疗方式,其效果可能是通过对CaMKⅡ的直接抑制和对活性氧簇的间接抑制而实现的。

电针对脑缺血再灌注大鼠脑缺血组织内VGLUT1表达及CaM/CaMKⅡ信号通路影响

目的选取“百会”“印堂”及双侧“足三里”穴进行电针干预,探讨电针对大脑中动脉栓塞(MCAO)模型大鼠脑缺血组织内VGLUT1表达的影响及对CaM/CaMKⅡ信号通路的影响。方法线栓法制备MCAO模型大鼠,依据神经功能评分标准,造模成功后的30只大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组和电针组,每组10只。造模成功后2 h,选取“百会”“印堂”及双侧“足三里”穴对电针组进行治疗,连续电针7 d。通过Morris水迷宫实验完成对大鼠学习和记忆能力的检测;HE染色法观察各组大鼠脑组织的形态学改变;免疫组化法检测各组大鼠脑缺血组织内VGLUT1表达水平;ELISA法检测各组大鼠脑缺血组织内CaM、CaMKⅡ表达水平。结果经电针治疗后,电针组大鼠神经功能评分较模型组显著降低(P<0.05);Morris水迷宫实验:与模型组相比,电针组大鼠穿过逃生平台的次数明显增多(P<0.01),其逃避潜伏期明显缩短(P<0.05);HE染色:模型组和电针组脑组织细胞均有不同程度的坏死或损伤,但电针组的组织形态学有明显改善;免疫组化法:与模型组比较,电针组大鼠脑缺血组织内VGLUT1表达水平明显升高(P<0.05)。ELISA法:与假手术组比较,模型组和电针组大鼠脑缺血组织内CaM、CaMKⅡ表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠脑缺血组织内CaM、CaMKⅡ表达水平明显降低(P<0.05)。结论电针“百会”“印堂”及双侧“足三里”穴能够明显改善脑缺血再灌注大鼠的学习和记忆能力,上调VGLUT1表达水平,增强突触传递效能,且能够抑制CaM/CaMKⅡ信号通路的活化,对脑组织产生一定的保护作用,对脑缺血再灌注损伤在临床上的治疗科学性提供了实验依据。

头穴丛刺结合康复训练对脑缺血再灌注大鼠肠道菌群及CaM/CaMKⅡ信号通路的影响

目的观察头穴丛刺结合康复训练对脑缺血再灌注大鼠肠道菌群及CaM/CaMKⅡ信号通路的影响。方法将大鼠随机分为假手术组(sham组)、脑缺血再灌注损伤模型组(CIRI组)、头穴丛刺组(SCA组)(头穴丛刺干预,1次/日,连续14 d)、康复训练组(RT组)(跑台训练,30 min/次/日,连续14 d)和头穴丛刺联合康复训练组(SCA+RT组)(头穴丛刺干预,同时进行跑台训练),每组12只。分别于造模成功后3、7、14 d对大鼠进行神经功能评分;干预14 d后采用TTC染色检测脑梗死面积,ELISA检测脑组织中COX2、NOS2水平,16S-rDNA测序检测结肠内容物肠道菌群变化,Western blot检测脑组织中CaM、CaMKⅡ蛋白表达情况。结果CIRI组大鼠神经功能评分,脑梗死面积,脑组织中COX2、NOS2含量,CaM、CaMKⅡ蛋白水平及OUT水平的Simpson指数均显著高于sham组,OUT水平的Shannon指数、Ace指数、Chao指数均显著低于sham组(均P<0.05);与CIRI组相比,SCA组、RT组和SCA+RT组大鼠神经功能评分,脑梗死面积,脑组织中COX2、NOS2含量,CaM、CaMKⅡ蛋白相对表达量,以及OUT水平的Simpson指数均显著降低,OUT水平的Shannon指数、Ace指数、Chao指数均显著升高(均P<0.05),且以SCA+RT组变化更显著。与sham组相比,CIRI组拟杆菌门、放线杆菌门、脱硫弧菌门、厚壁菌门、双歧杆菌属、norank-f-Muribaculaceae、杜氏杆菌属、拟普雷沃菌属、红蝽菌属_UCG-002、普雷沃菌属菌落相对丰度显著降低,变形菌门菌落、贺菌群属菌落对丰度显著升高(均P<0.05);与CIRI组相比,SCA组、RT组和SCA+RT组拟杆菌门、放线杆菌门、脱硫弧菌门、厚壁菌门、双歧杆菌属、norank-f-Muribaculaceae、杜氏杆菌属、拟普雷沃菌属、红蝽菌属_UCG-002、普雷沃菌属菌落相对丰度显著升高,变形菌门菌落、贺菌群属相对丰度显著降低(均P<0.05),且以SCA+RT组变化更显著。结论头穴丛刺结合康复训练可改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能,调节肠道菌群失调,抑制CaM/CaMKⅡ信号通路的活化,从而对脑组织发挥保护作用。

肾元颗粒通过调控FGF23/CaMKⅡ信号通路对糖尿病肾病db/db小鼠心肌肥大与凋亡的影响

目的:通过观察db/db糖尿病肾病(DN)小鼠的心肌肥大和心肌损伤,进而探讨肾元颗粒改善DN小鼠心肌肥大和凋亡的可能作用机制。方法:db/db小鼠45只随机分为模型组、厄贝沙坦组和肾元颗粒组,15只同背景野生型(WT)小鼠为空白组。ELISA检测血清成纤维细胞生长因子23(FGF23)和尿微量白蛋白含量;全自动生化仪检测肾功能;小鼠肾脏和心脏病理采用HE和Masson染色;Real-time PCR肾脏Kl和心脏ANP、Bax、Bcl-2 mRNA;Western blot检测肾脏Kl和心脏Bax、Bcl-2蛋白;免疫组化检测心脏ANP、p-CaMKⅡ蛋白含量。结果:与空白组比较,模型组小鼠肾单位出现受损,小球系膜基质增多,基底膜增厚,肾小管上皮细胞肥大,心脏心肌细胞排列紊乱,体积增大,伴有明显的胶原纤维沉积,血清FGF23、BUN、Scr和24h尿微量白蛋白含量增加(P<0.01),肾脏Kl mRNA和蛋白显著减少(P<0.01),心脏ANP mRNA、Bax mRNA和蛋白表达增加(P<0.01),Bcl-2 mRNA和蛋白表达量减少(P<0.01),心脏p-CaMKⅡ蛋白含量增加;灌胃12周后,肾元颗粒组和厄贝沙坦组肾脏和心脏病理表现均显著减轻,血清FGF23含量减少(P<0.05,P<0.01),肾脏Kl和心脏Bcl-2mRNA和蛋白含量增加(P<0.01),心脏ANP mRNA和Bax mRNA及蛋白含量减少(P<0.01),心脏p-CaMKⅡ蛋白表达减少。结论:肾元颗粒可通过上调肾脏Kl蛋白表达,降低CaMKⅡ活性,抑制FGF23/CaMKⅡ信号通路来抑制肥大细胞表达,降低凋亡的发生,达到心肌细胞的保护作用。

黄芩苷对扩张型心肌病大鼠心室重构、心室肌细胞凋亡及β1-AR/PKA/CaMKⅡ信号通路的影响

目的：探讨黄芩苷对阿霉素（ADR）诱导扩张型心肌病大鼠心室重构、心室肌细胞凋亡及β_1肾上腺素受体（β_1-AR）/蛋白激酶A（PKA）/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）信号通路的影响。方法：雄性Wistar大鼠60只,随机分为正常组、模型组、黄芩苷低、中、高剂量组及卡维地洛组;模型组给予ADR 2 mg·kg^（-1）腹腔注射,黄芩苷组及卡维地洛组在模型组基础上分别给予黄芩苷（25,50,100 mg·kg^（-1）·d^（-1））,卡维地洛10 mg·kg^（-1）·d^（-1）灌胃,正常组给予等体积0.9%NaCl腹腔注射,1次/周,共3次;7周末各组大鼠行心脏超声检测心室变化及心功能指标;酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组大鼠血清氨基末端脑钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-pro BNP）,人基裂解素（human stromelysin-2,ST2）含量;采用原位末端转移酶标记法（TUNEL）染色观察各组大鼠心室肌细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组大鼠心室肌组织中β_1-AR,PKA及CaMKⅡ表达。结果：与正常组比较,模型组大鼠出现心室重构明显及心功能减弱（P〈0.05）,血清NT-proBNP,ST2含量增多（P〈0.05）,心室肌细胞凋亡数量增加（P〈0.05）,心室肌组织中β_1-AR,PKA及CaMKⅡ表达增多;与模型组比较,黄芩苷及卡维地洛组大鼠心室重构及心功能改善（P〈0.05）,血清NT-pro BNP,ST2含量降低（P〈0.05）,心室肌凋亡数量减少（P〈0.05）,心室肌组织中β_1-AR,PKA及CaMKⅡ表达减少（P〈0.05）。结论：黄芩苷可有效改善ADR诱导的扩张型心肌病大鼠心室重构,减少心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制心室肌细胞β-AR/PKA/CaMKⅡ信号通路表达有关。

银杏二萜内酯葡胺对阿尔茨海默病大鼠学习记忆障碍的改善作用

目的探讨银杏二萜内酯葡胺对阿尔茨海默病(AD)大鼠学习记忆障碍的改善作用及对突触相关蛋白表达的影响。方法40只大鼠随机分为假手术组、模型组和银杏二萜内酯葡胺低、中、高剂量组(15、30、60 mg/kg)。通过侧脑室定位注射Aβ_(1-42)建立AD大鼠模型,尾静脉注射给药4周后,通过Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力,蛋白免疫印迹法检测大鼠脑组织海马中突触蛋白NR2B、PSD95、BDNF表达,以及下游信号通路蛋白ERK1/2、CaMKⅡ、CREB、TrkB表达。结果与模型组比较,银杏二萜内酯葡胺中、高剂量组大鼠逃避潜伏期缩短(P<001),穿越平台次数、目标象限停留时间和游程增加(P<001),海马p-NR2B、p-CaMKⅡ、p-ERK、p-CREB、PSD95、BDNF、p-TrkB蛋白表达升高(P<001)。结论银杏二萜内酯葡胺能改善AD大鼠学习记忆能力,其机制可能与激活NR2B相关的CaMKⅡ/ERK/CREB信号通路,增强PSD95、BDNF表达,激活TrkB信号通路相关。

Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ在心力衰竭中的作用机制及中医药治疗应用进展

心力衰竭是一种常见的多发病,是各种心脏疾病发展的终末阶段,发病机制十分复杂,严重危害着人类健康。大量研究表明Ca^(2+)/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca^(2+)/Calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)在心力衰竭的发生发展中起着重要的作用。中医药在防治心力衰竭方面具有独特优势和良好前景,其中有不少可靶向调节CaMKⅡ的复方和中药有效成分。本文就CaMKⅡ信号通路在衰竭心脏中的作用机制以及近年来中医药通过靶向调节CaMKⅡ信号防治心力衰竭研究进展作主要阐述,以期为临床中医药防治心力衰竭方面提供参考意见并拓展思路。

化合物DXL-A-22抗神经病理性疼痛作用及机制研究

目的研究螺环哌嗪季铵盐化合物DXL-A-22抗神经病理性疼痛作用及机制。方法以坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型评价DXL-A-22的抗神经病理性疼痛作用;Westernblot和qPCR技术研究DXL-A-22的作用机制;极限实验评价DXL-A-22的急性毒性。结果与溶媒组比较,DXL-A-22(2、1、0.5mg·kg^-1,i.g.)剂量依赖性提高CCI大鼠机械刺激缩足反应阈值和热刺激缩足潜伏期(P<0.05,P<0.01),术后d7痛阈提高率分别为108%、86%和71%,最大镇痛百分率分别为77%、56%和43%;DXL-A-22(2mg·kg^-1)明显降低背根神经节(DRG)p-CaMKⅡα、p-CREB,p-JAK2、p-STAT3蛋白表达,以及TNF-α、c-FosmRNA表达(P<0.05,P<0.01),抑制率分别为37%、48%、35%、58%、39%和32%;明显降低脊髓TNF-α、c-FosmRNA表达(P<0.01),抑制率分别为47%和72%;无明显毒性反应。结论螺环哌嗪季铵盐化合物DXL-A-22能明显抑制大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤引起的神经病理性疼痛,无明显毒性,其机制可能与抑制DRGCaMKⅡα/CREB和JAK2/STAT3信号通路,降低DRG及脊髓TNF-α、c-FosmRNA表达相关。

miR-145过表达对缺氧诱导心肌细胞焦亡的抑制作用及其机制

目的观察miR-145过表达对缺氧诱导心肌细胞焦亡的抑制作用并探讨其机制。方法将大鼠心肌细胞H9C2分为正常组、缺氧组、缺氧+miR-145组、缺氧+阴性对照组,缺氧+miR-145组、缺氧+阴性对照组分别使用腺病毒包装的miR-145及腺病毒包装的阴性对照序列进行腺病毒感染,正常组、缺氧组不做腺病毒感染处理;24 h后将缺氧组、缺氧+miR-145组、缺氧+阴性对照组细胞转移至缺氧培养箱中培养24 h,正常组不做缺氧诱导。采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-145水平,超氧化物阴离子探针检测细胞内活性氧水平,TUNEL染色及流式细胞术观察细胞焦亡情况,免疫组织化学及实时荧光定量PCR法检测细胞焦亡相关因子NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、(IL-1β)、白细胞介素1β(IL-18)水平,Western blotting法检测钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)/核转录因子κB(NF-κB)信号通路相关蛋白磷酸化CaMKⅡ、磷酸化NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达。结果心肌细胞miR-145 mRNA相对表达量缺氧+miR-145组>正常组>缺氧组、缺氧+阴性对照组,心肌细胞ROS水平缺氧组、缺氧+阴性对照组>缺氧+miR-145组>正常组,心肌细胞TUNEL阳性率及焦亡率缺氧组、缺氧+阴性对照组>缺氧+miR-145组>正常组,心肌细胞NLRP3蛋白及NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA表达缺氧组、缺氧+阴性对照组>缺氧+miR-145组>正常组,心肌细胞CaMKⅡ、磷酸化CaMKⅡ、NF-κB、磷酸化NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达缺氧组、缺氧+阴性对照组>缺氧+miR-145组>正常组(P均<0.05)。结论miR-145过表达可减轻缺氧诱导的心肌细胞焦亡,其机制可能与抑制CaMKⅡ/NF-κB信号通路有关。