瘤背石磺钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)基因的克隆及组织表达

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)是一种广泛存在于真核生物中的调控因子,在生物体内具有多种生理功能。为了探究瘤背石磺中CaMKⅣ的作用和分子机制,为进一步阐述CaMKⅣ的生理功能提供科学的理论依据。本实验以瘤背石磺神经节为实验材料,利用RACE-PCR技术克隆得到CaMKⅣ基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和qRT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺CaMKⅣ基因的cDNA全长1603bp,开放阅读框为1032bp,5′非编码区315bp,3′非编码区256bp,共编码343个氨基酸;预测该基因编码的多肽链原子数量是5490,分子量约为3.87ku,理论等电点6.12,分子式为C1741H2768N452O514S15,N端信号肽由1~29个氨基酸组成。氨基酸序列比对及系统进化树结果显示,瘤背石磺CaMKⅣ基因与加州海兔、光滑双脐螺CaMKⅣ基因的亲缘关系最为接近,其系统进化分析与传统的形态学分类相吻合。荧光定量PCR结果显示,CaMKⅣ基因在各个组织均有表达,其中在腹足的相对表达量最高,其次是背部皮肤、口器,而在神经节组织、蛋白腺、肠、肝胰腺等脏器组织的相对表达量较低,初步推测,该基因在瘤背石磺的神经调节中发挥重要作用,或为生物机体感知外界环境变量因素的分子基础。本实验为今后进一步了解瘤背石磺神经结构生理功能的调节以及与CaMKⅣ基因功能研究奠定理论支撑,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供参考。

CaMKⅣ在子宫内膜癌细胞中表达的研究

目的:探讨CaMKⅣ在子宫内膜癌发病中的作用。方法:采用免疫组化方法,检测31例子宫内膜癌患者和20例正常子宫内膜标本中CaMKIV的表达强度,同时分析CaMKⅣ染色细胞的百分数与患者临床特征的关系(临床分期、组织分级和临床预后)。结果:正常子宫内膜组织细胞无CaMKⅣ的表达,CaMKⅣ表达主要在子宫内膜癌细胞核内,表达的强弱与临床分期和预后有关。结论:CaMKⅣ在子宫内膜癌组织中的表达与子宫内膜癌的恶性程度有关。

CaMKⅣ信号缺失促进肌损伤炎症并影响肌再生

目的探究CaMKⅣ信号对肌损伤炎症反应及肌修复的调控作用。方法采用CRISPR/Cas9技术构建CaMKⅣ基因缺失(CaMKⅣ^(-/-))小鼠,PCR表型鉴定。心脏毒素(Cardiotoxin,CTX)诱导野生B6鼠及CaMKⅣ^(-/-)鼠急性肌损伤。HE染色观察损伤肌内炎症程度及肌修复过程。Dystrophy、F4/80免疫荧光双标,观察损伤肌内巨噬细胞渗出差异。F4/80、Ly-6C、CD206、Ki67染色及流式检测,分析损伤肌内M1、M2巨噬细胞的数量和比例,以及M1、M2巨噬细胞的局部增殖能力。结果成功构建并繁殖CaMKⅣ^(-/-)鼠。HE及荧光染色观察证实小鼠体内CaMKⅣ信号缺失可致肌内炎症加剧、肌修复延迟。CaMKⅣ^(-/-)小鼠损伤肌内再生的中央核肌纤维(Dystrophin^(+))数量低于WT鼠,巨噬细胞(F4/80^(+))数量显著高于WT鼠,以M1细胞(F4/80^(+)Ly-6C^(+))为主,M2细胞(F4/80^(+)CD206^(+))比例低于WT鼠。CaMKⅣ^(-/-)鼠损伤肌内增殖巨噬细胞(F4/80^(+)Ki67^(+))数量显著高于对照鼠,但以增殖的M1细胞为主(Ly6C^(+)Ki67^(+)),M2细胞(CD206^(+)Ki67^(+))的增殖与对照鼠无显著差异。结论CaMKⅣ信号缺失可致肌损伤炎症加剧、促进损伤肌内M1巨噬细胞的渗出及增殖,延误肌修复。

愈痫灵方对PTZ致痫鼠认知功能障碍与海马p-CREB、CaMK Ⅳ表达的影响

目的分析愈痫灵方对海马磷酸化环磷腺苷应答元件结合蛋白(CREB)、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMK Ⅳ)的关系和表达变化,探讨愈痫灵方改善戊四氮(PTZ)致痫鼠认知功能障碍的影响。方法取健康雄性SD大鼠120只,从中随机选取10只作为正常对照组,其余大鼠用戊四氮造模,将符合模型标准的大鼠随机抽取60只分为愈痫灵组、拉莫三嗪组、丙戊酸钠组和模型组,每组15只。灌胃后用水迷宫实验测试大鼠的学习记忆能力,采用免疫组织化学方法检测p-CREB、Ca MK Ⅳ在海马体CA1区的表达变化。结果各组大鼠水迷宫实验潜伏期和总路程的学习记忆成绩比较有显著统计学意义(P<0.001):模型组与正常组比较,差异有显著统计学意义(P<0.001);拉莫三嗪组、愈痫灵组与模型组比较,差异有显著统计学意义(P<0.001)。愈痫灵方对致痫鼠海马CA1区P-CREB、CaMK Ⅳ表达的影响:各组之间表达的比较,差异有显著统计学意义(P<0.01);模型组与正常组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01);愈痫灵组、拉莫三嗪组与模型组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论愈痫灵方可以通过增强海马区p-CREB的水平,提高P-CREB的上游通路CaMK Ⅳ,改善致痫大鼠的学习记忆能力。

补肾方药延缓老年大鼠学习记忆减退的分子机制

目的:观察补肾方药左归丸、右归丸对老年大鼠空间学习记忆能力,氨基酸神经递质以及NMDA受体、Ca2+/CaMKⅣ信号通路相关分子的mRNA表达变化的影响,以探讨老年大鼠学习记忆减退的分子机制以及补肾方药的药理作用。方法:以青年大鼠(5月龄)为对照,以自然衰老大鼠(23月龄)为模型;Morris水迷宫法观察大鼠空间学习记忆能力;HPLC-荧光法检测大鼠杏仁核、海马氨基酸类神经递质含量;RT-PCR法检测大鼠海马NR1、CaMKⅣ、CREB、c-fos mRNA的表达变化;观察补肾方药左归丸、右归丸对老年大鼠上述各项指标的影响。结果:与青年对照组比较,老年大鼠上述指标都有不同程度的异常变化,而左归丸、右归丸可改善老年大鼠退化的空间学习记忆能力;降低老年大鼠杏仁核、海马Glu的含量;显著上调老年大鼠NR1、CaMKⅣmRNA的表达,对CREB及c-fos mRNA的表达也有升高。结论:左归丸、右归丸可以通过降低老年大鼠杏仁核、海马Glu含量,纠正NMDA受体介导的CaMKⅣ信号通路的异常变化,改善老年大鼠空间学习记忆能力,延缓衰老。

miR-431调控CaMK Ⅳ信号通路参与坏死性小肠结肠炎症的机制

[目的]探讨miR-431调控CaMKⅣ信号通路对新生大鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)的影响。[方法]将新生SD雄性大鼠32只随机分为对照组、模型组、阴性对照组、miR-431 antagomir组,每组8只。通过苏木素-伊红(HE)染色对各组大鼠进行肠组织病理评分;酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组IL-6、TNF-α表达水平;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组miR-431、CaMKⅣmRNA的表达水平;蛋白印迹(Western blot)检测各组CaMKⅣ蛋白及pCaMKⅣ蛋白的表达水平。[结果]对照组肠组织结构清晰,上皮完整,腺体规则排列,无黏膜层及黏膜下层充血水肿及炎症细胞浸润;模型组及阴性对照组肠组织坏死严重,腺体排列紊乱,黏膜下层或固有层有重度分离,黏膜下层和肌层有严重水肿,绒毛崩解分离和缺血坏死,存在大量炎症细胞浸润,IL-6、TNF-α、miR-431、CaMKⅣmRNA及蛋白、pCaMKⅣ蛋白表达水平显著升高(P<0.05);miR-431 antagomir组肠道组织充血水肿情况较模型组减轻,腺体排列稍显紊乱,肠黏膜及黏膜下层可见轻度水肿,有少量炎症细胞浸润,IL-6、TNF-α、miR-431、CaMKⅣmRNA及蛋白、pCaMKⅣ蛋白表达水平较模型组和阴性对照组显著降低(P<0.05)。[结论]敲低miR-431的表达可减轻NEC新生大鼠的炎症水平,改善其肠组织的损伤情况,其机制可能与miR-431低表达抑制CaMKⅣ信号通路活化有关。

钙离子调节蛋白依赖激酶在子宫内膜癌细胞中表达的研究

目的探讨钙离子调节蛋白依赖激酶(CaMKⅣ)在子宫内膜癌发病中的作用。方法采用免疫组化方法,检测31例子宫内膜癌患者和20例正常子宫内膜标本中CaMKⅣ的表达强度,同时分析CaMKⅣ染色细胞的百分数与患者临床特征的关系(临床分期、组织分级和临床预后)。结果正常子宫内膜组织细胞无CaMKⅣ的表达,CaMKⅣ表达主要在子宫内膜癌细胞核内,表达的强弱与临床分期和预后有关。结论CaMKⅣ在子宫内膜癌组织中的表达与子宫内膜癌的恶性强度有关。