柴金解郁安神片调控CaMKII和Cofilin双信号通路改善抑郁症海马谷氨酸能神经元突触重塑

目的探讨柴金解郁安神片调控钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)和Cofilin双信号通路,改善抑郁症海马谷氨酸能神经元突触重塑的分子机制。方法皮质酮联合脂多糖建立抑郁症体外细胞模型,实验设正常组、模型组、GR阻断剂组、GR激动剂组、CX3CR1阻断剂组、CX3CR1激动剂组、柴金解郁安神片组、柴金解郁安神片联合GR激动剂组、柴金解郁安神片联合CX3CR1激动剂组,观察星形胶质细胞、小胶质细胞、前扣带皮层(anterior cingulate cortex,ACC)和海马神经元形态结构变化;检测ACC和海马谷氨酸能神经元激活及突触重塑情况;免疫荧光、Western blot分别检测海马谷氨酸能神经元内突触重塑相关谷氨酸受体2A(GRIN2A)、GRIN2B、CaMKII、MK2、Cofilin蛋白表达水平。结果柴金解郁安神片能明显改善胶质细胞、ACC和海马神经元损伤,并抑制ACC和海马谷氨酸能神经元异常激活,同时下调GRIN2A、GRIN2B、MK2蛋白,上调CaMKII、Cofilin蛋白,继而改善海马谷氨酸能神经元突触可塑性损伤和突触重塑。结论柴金解郁安神片能有效改善抑郁症海马谷氨酸能神经元突触重塑,其分子机制与调节突触重塑相关NR/CaMKII、MK2/Cofilin信号通路有关。

CaMKⅡ参与调控成骨细胞分化和凋亡的研究进展

成骨细胞分化和凋亡在维持骨稳态中起着至关重要的作用,异常的成骨细胞分化或凋亡会导致多种骨代谢疾病。钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一类广泛存在于体内的多功能蛋白激酶家族,它通过将细胞内的Ca^(2+)信号转化为多种生理或病理的细胞反应,在成骨细胞的分化和凋亡调控中发挥着重要作用。CaMKⅡ对成骨细胞分化的影响主要通过3个信号通路实现:(1)通过1α-25(OH)_(2)D_(3)膜介导信号通路调节成骨细胞的分化;(2)参与WNT/Ca^(2+)信号通路;(3)通过RUNX2-OSX信号通路影响成骨细胞分化。这些信号通路共同作用于成骨细胞,促进其成熟和功能发挥。CaMKⅡ在成骨细胞凋亡中的作用则涉及调节内质网应激反应和调控Bax/Bcl-2表达比例。这些机制对于成骨细胞的存活和凋亡至关重要,影响骨组织的稳定性和重建。总体而言,CaMKⅡ作为一个多功能信号分子,在成骨细胞分化和凋亡的调控中扮演重要角色。对CaMKⅡ的进一步研究,特别是在骨代谢疾病治疗中的应用,是未来研究的一个重要方向。

基于CaMKⅡ/CREB/BDNF信号通路麦粒灸对抑郁大鼠行为学及海马神经保护作用机制研究

目的:探讨麦粒灸对抑郁大鼠行为学、海马区环磷腺苷效应原件结合蛋白(CREB)的影响及对突触功能和突触可塑性的调控作用,探究麦粒灸对抑郁大鼠的防治作用及机制。方法:将40只SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、麦粒灸组、氟西汀组,每组10只。孤养+慢性不可预见性应激(CUMS)21 d复制抑郁大鼠模型。造模第1~21天,麦粒灸组在造模前1 h给予麦粒灸“心俞”“肝俞”“脾俞”“肾俞”穴3壮预防治疗,1次/d。同期氟西汀组予氟西汀溶液[1 mg/mL,10 mL/(kg·d)]灌胃治疗。观察各组大鼠的体质量及行为学改变。21 d后,行为学检测后2 h内解剖大鼠取出海马组织。免疫细胞化学技术(IHC)检测海马组织脑源性神经营养因子(BDNF)、代谢型谷氨酸受体1(mGluR1)、GluR1阳性表达情况。RT-PCR法检测海马组织BDNF mRNA和CREB mRNA相对表达量。Western blotting法检测CREB、BDNF、CaMKⅡ蛋白相对表达量。结果:与空白组比较,模型组大鼠体质量、糖水偏好率及旷场实验垂直运动频率和水平移动距离均下降(P<0.01),强迫游泳实验静止时间明显延长(P<0.01);IHC结果显示模型组mGluR1阳性表达明显升高(P<0.01),BDNF、GluR1阳性表达明显减少(P<0.01);Western blotting结果显示模型组CaMKⅡ、CREB和BDNF蛋白表达均显著下降(P<0.05);RT-PCR结果显示模型组CREB mRNA和BDNF mRNA表达均减少(P<0.01)。与模型组比较,麦粒灸组及氟西汀组以上指标出现相反变化(P<0.05)。麦粒灸组GluR1阳性表达高于氟西汀组(P<0.05)。两组其余各参数比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:麦粒灸法可通过调节抑郁大鼠CaMKII/CREB/BDNF信号通路相关蛋白质的表达,减轻谷氨酸诱导的神经毒性,发挥抗抑郁作用。

慢性复合性应激大鼠学习和记忆与海马突触后致密物质CaMKII的表达变化

目的 探讨慢性复合性应激对大鼠学习和记忆的影响 ,Ca2 + 钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)的表达 ,及其在学习与记忆中的作用。 方法 采用行为训练和免疫组织化学相结合的方法 ,将大鼠随机分为应激组和对照组 ,应激组动物进行 6周的慢性复合性应激试验。实验后 ,动物进行 3d的Morris水迷宫和Y迷宫测试 ,记录其学习和记忆成绩 ,同时观察CaMKII在海马CA1和CA3区的分布和表达。 结果 应激组动物的学习与记忆成绩均超过或优于对照组 (P <0 0 5 ,P <0 0 1) ;与对照组比较 ,CaMKII在应激组海马CA3区辐射层灰度明显降低(P <0 0 1) ,而始层灰度无明显变化 (P >0 0 5 ) ,在应激组CA1区海马辐射层和始层的灰度均较对照组降低 (P <0 0 5 ) ;大鼠的学习记忆成绩与CaMKII的表达呈正相关。 结论 慢性复合性应激致大鼠的学习与记忆能力加强 ,CaMKII在海马CA1区和CA3区的表达增加 ,说明CaMKII参与了慢性复合性应激对学习记忆的影响。

β1肾上腺素受体与心衰、高血压和心肌纤维化之间的关系研究进展

β1肾上腺素受体(β1 adrenergic receptor,β1-AR)是心脏组织中肾上腺素受体的主要亚型。β1-AR基因表达变化与心衰、高血压等心血管疾病的发生、发展及治疗密切相关。β1-AR激活后,启动经典的G蛋白-腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷-蛋白激酶A(Gs-AC-cAMP-PKA)信号转导通路。但当机体发生病理性改变时,β1-AR信号通路发生变化。持久兴奋β1-AR,从而激活CaMKII,使心肌收缩增强,心率加快,诱发心肌细胞肥大及凋亡,最终导致心肌重塑、心肌收缩及舒张功能下降。深入了解β1-AR调控在心衰、高血压等心血管疾病发病过程中的分子机制及β1-AR基因多态性和甲基化对个体化治疗的影响,将为临床治疗心血管疾病制定合理化用药方案提供依据和指导。

皮质酮对原代培养的海马神经元及其Ca^(2+)/CaMKII的影响

在培养液中加入 10 7、10 6和 10 5浓度(mol/L)的皮质酮,采用MTT染色测定、Fura 2 /AM的荧光标记以及Western印迹的方法,观察了不同浓度的皮质酮作用下海马神经元形态学和细胞存活率的变化以及胞浆内游离钙离子浓度 [Ca2+ ]i和CaMKII表达的变化规律, 探讨其对原代培养的大鼠海马神经元及其Ca2+ /CaMKII的影响和可能的机制。结果发现: 10 6、10 5浓度的皮质酮对海马神经元的形态学影响较大,与对照组比较,细胞存活率明显降低; [Ca2+ ]i分别为 113. 1022±16. 9716、155.3794±20. 7727;CaMKII的表达也明显减少;三者的变化均显著 (P<0. 01 ),而 10 7浓度的皮质酮对上述指标影响不大 (P>0.05)。此外,相关性分析表明: [Ca2+ ]i和CaMKII的表达呈现负相关(P<0. 05)。以上结果提示,皮质酮对大鼠海马神经元的作用存在浓度依赖效应,浓度越高,对大鼠海马神经元的损伤越大,同时也验证了皮质酮是啮齿类动物的主要的应激激素。

麝香保心丸防治动脉粥样硬化的实验研究

目的研究慢性炎症反应与动脉粥样硬化的关系及麝香保心丸防治动脉粥样硬化的作用机制。方法新西兰雄性大耳白兔60只,随机分为5组,即空白对照组,模型组,麝香保心丸低、高剂量组,立普妥组。高脂饲料造模4周后再连续给药6周,末次给药后(空腹大于12 h)耳动脉采血,麻醉后取主动脉,检测血脂及炎症因子,观察各组动物动脉内膜病理形态的改变,检测Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKⅡ)蛋白表达及Ca MKII的活性。结果与模型组比较,麝香保心丸低、高剂量组及立普妥组的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)水平及动脉粥样斑块数量、厚度均有明显降低,Ca MKII蛋白含量及活性均有明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论麝香保心丸具有抗实验性新西兰大耳兔动脉粥样硬化的作用,并可能与降低CaMKⅡ蛋白含量或活性,减轻或抑制慢性炎症反应有关。

海马齿状回的内质网应激参与AD模型大鼠空间学习记忆损伤的机制

目的:探讨海马齿状回(DG)的内质网应激(ERS)损伤阿尔茨海默病(AD)大鼠空间学习和记忆功能的分子机制。方法:60只SD系雄性大鼠(3月龄)随机分为空白(control)组和AD模型(AD)组,AD大鼠侧脑室注射1次链脲佐菌素(2.4 mg/kg),3 d后开始腹腔注射D-半乳糖(60 mg·kg^(−1)·d^(−1))共6周,而control大鼠以相同方法注射生理盐水。Morris水迷宫评估大鼠的空间学习记忆能力;透射电镜观察大鼠海马DG区超微结构;Westernblot法检测海马DG区的葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、Ca^(2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、细胞外信号调节激酶(ERK)和脑源性神经营养因子(BDNF)的水平,并通过腹腔注射ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)和ERK通路抑制剂PD98059探讨DG区ERS损伤AD大鼠空间学习和记忆功能的下游机制。结果:与control大鼠比较,AD大鼠海马DG区的超微结构明显受损,包括突触结构损伤、粗面内质网排列紊乱及核糖体脱落,其ERS标志蛋白GRP78和p-PERK的水平显著升高(P<0.05)。与control大鼠比较,AD大鼠的空间学习和记忆能力显著下降(P<0.05),海马DG区p-CaMKII、p-ERK和BDNF的水平显著降低(P<0.05);4-PBA可改善AD大鼠的空间学习和记忆能力,同时提高海马DG区p-CaMKII、p-ERK和BDNF的水平(P<0.05)。利用PD98059抑制ERK通路可反转4-PBA增加AD大鼠海马DG区BDNF表达的作用(P<0.05)。结论:海马DG区ERS可能通过抑制CaMKII/ERK/BDNF通路损伤AD大鼠的空间学习和记忆功能。

三七总皂苷对大鼠急性重症胰腺炎钙超载中CaMKⅡ-γ表达的影响

目的探讨三七总皂苷是否降低胰腺炎大鼠胰腺组织中钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ-γ(CaMKⅡ-γ)基因和蛋白水平的表达,降低细胞钙超载的程度,减轻急性重症胰腺炎时胰腺组织的损伤。方法雄性SD大鼠120只,随机分为3组:假手术(SO)组、重症急性胰腺炎(SAP)组、三七总皂苷干预(PNS)组。检测3组大鼠的血清淀粉酶(AMS)、细胞内Ca2+浓度、胰腺组织内CaMKⅡ-γmRNA及CaMKⅡ-γ蛋白的表达量、并对大鼠胰腺石蜡切片进行病理评分。结果 SAP组及PNS组在术后4h、8h、12h和24h的血清淀粉酶、胰腺组织CaMKⅡ-γmRNA的表达量、胰腺组织CaMKⅡ-γ蛋白表达量、胰腺组织病理评分及胰腺细胞内Ca2+浓度均明显高于SO组(P均<0. 05),其中SAP组在术后8h、12h的胰腺组织CaMKⅡ-γmRNA及CaMKⅡ-γ蛋白表达量均明显高于PNS组(P均<0. 05),SAP组在术后8h、12h、24h的胰腺组织病理评分及胰腺细胞内Ca2+浓度均明显高于PNS组(P均<0. 05)。结论 1. CaMKⅡ-γ在大鼠SAP模型中高表达,其与大鼠胰腺炎钙超载的发生有关。2.三七总皂苷可以通过降低CaMKⅡ-γ在胰腺组织内的表达,减轻胰腺细胞钙超载的程度,对胰腺组织起到保护作用。

运动训练对2型糖尿病大鼠心肌Ca^(2+)-CaMKII信号调节的能量代谢转换的影响

目的探讨运动训练对糖尿病大鼠心肌细胞Ca2+-CaMKII信号调节、葡萄糖摄取量及能量代谢转换的影响。方法采用健康雄性SD大鼠进行跑台运动训练,正常组对照8只及糖尿病组28只,糖尿病组再分为糖尿病对照组8只、罗格列酮干预组10只及运动训练干预组10只。采用Fura-2/AM测定心肌细胞[Ca2+]i,采用同位素液闪计数法测定CaMKII活性、PDH活性及葡萄糖氧化量。采用同位素示踪技术测定葡萄糖摄取量。采用3H标记的棕榈酸测定脂肪酸氧化速率。结果与正常对照组比较,糖尿病对照组[Ca2+]i、CaMKII活性、PDHa、葡萄糖摄入量、葡萄糖代谢率及脂肪酸代谢率均有明显差异(P<0.01)。与糖尿病对照组比较,罗格列酮组[Ca2+]i、CaMKII活性、PDHa无明显差异(P>0.05),葡萄糖摄入量明显增加(P<0.05);葡萄糖氧化率增高(P<0.05),脂肪酸氧化率降低不明显(P>0.05);运动训练组[Ca2+]i降低(P<0.01),CaMKII活性、PDHa、葡萄糖摄入量、葡萄糖代谢率均明显提高(P<0.01),脂肪酸代谢率明显降低(P<0.01)。与罗格列酮组比较,运动训练组CaMKII活性、PDHa、葡萄糖代谢率明显增强(P<0.05),[Ca2+]i及脂肪酸代谢率明显降低(P<0.01);葡萄糖摄入量无明显差异(P>0.05)。结论运动训练可以明显改善Ca2+-CaMKII信号调节的糖尿病心肌细胞的能量代谢转换,在临床治疗方面较单纯增加葡萄糖摄取量更有意义。

钙离子信号对非细胞体系中小鼠卵母细胞游离生发泡减数分裂启动的影响

本文构建了包括HeLa裂解液和游离小鼠卵母细胞生发泡的实验体系,用于研究Ca^(2+)及其下游信号对小鼠卵母细胞减数分裂启动的影响。游离的卵母细胞生发泡可以在M期细胞裂解液中发生减数分裂启动,表现为染色质的凝集。进一步的研究表明,Ca^(2+)信号的存在对G_2期细胞裂解液促进减数分裂启动是至关重要的,G_2期中期的细胞裂解液只有经Ca^(2+)诱导后才具有启动生发泡减数分裂的作用,而G_2期晚期无论Ca^(2+)存在与否均诱发减数分裂的启动,但是G_2期早期的裂解液无启动减数分裂的作用。卵母细胞的体外培养实验分析也表明,抑制CaM和CaMKⅡ的活性可以阻止GVBD和抑制第一极体的释放。免疫沉淀及Western Blotting结果显示,HeLa细胞裂解液中的MPF从G_2期中期到M期均存在,且Cdc2亚基的Tyr由磷酸化向去磷酸化转变。结果进一步证明,卵母细胞减数分裂的启动可能是通过一种Ca^(2+)/CaM依赖的途径来推动的。

吗啡戒断性焦虑大鼠VTA和NAc脑区/核团CaMKⅡ含量与磷酸化水平改变

目的:研究阿片类药物依赖戒断后焦虑产生的分子机制。方法:选用健康雄性SD大鼠48只,随机分为生理盐水对照组、模型组和丁螺环酮治疗组。采用剂量递增法皮下注射吗啡10d,自然戒断,并在自然戒断的1～3d给予丁螺环酮15mg/kg灌胃治疗(2次/d),于末次吗啡注射后72h,高架十字迷宫检测大鼠焦虑行为后,用Western Blot法检测各组大鼠奖赏系统中脑腹侧被盖区(VTA)和伏核(NAc)神经细胞钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)的含量和磷酸化水平。结果:与生理盐水对照组比较,模型组大鼠CaMKⅡ蛋白含量和β亚基磷酸化水平均显著升高(P<0.01);与丁螺环酮组比较,模型组CaMKII蛋白的含量与β亚基的磷酸化水平同样显著增高(P<0.01)。结论:奖赏系统VTA和NAc神经细胞CaMKⅡ含量、CaMKIIβ亚基磷酸化水平的增高可能是吗啡依赖戒断焦虑行为产生的分子机制之一。

运动对大鼠骨骼肌CaMKⅡ磷酸化水平及核内PGC-1、HDAC5蛋白含量的影响

目的:研究运动后不同时间大鼠骨骼肌CaMKⅡ磷酸化水平及核内PGC-1、HDAC5蛋白含量的变化,以探讨运动后PGC-1α基因表达时相性变化的调节机制。方法:9周龄的雄性Wistar大鼠(167±4)g 48只,随机分成安静对照组(C)和跑台运动后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h取材组,共6组,每组8只。大鼠进行0坡度的1 h跑台运动,跑台速度34 m/min。Western blot法测定蛋白含量及磷酸化水平,RT-PCR法测定基因表达。结果:PGC-1αmRNA含量,运动后即刻变化不显著,运动后3 h、6 h显著增加,12 h虽仍高于对照组,但与6 h相比显著降低,24 h恢复至安静水平。核内PGC-1α蛋白含量运动后各取材点均无显著变化。核内HDAC5蛋白含量则在运动后3 h、6 h下降显著,12 h虽仍低于对照组,但与6h相比显著增加,24 h恢复到安静组水平。CaMKⅡ磷酸化水平,运动后0 h,3 h显著升高,6 h虽仍高于对照组,但与3 h相比显著降低,12 h恢复至安静水平。结论:运动后PGC-1α基因表达的时相性变化可能是由对应时相变化规律的CaMKⅡ通过调节核内HDAC5含量,解除了转录因子对PGC-1α基因转录的抑制而实现。

PI3K-Akt信号而非CaMKIIγ参与CaMKIIδ敲除后的心肌肥厚反应

在2009年5月1日出版的《临床研究杂志》(J Clin Invest)刊载了一篇关于心力衰竭的研究论文,题为"CaMKII参与压力负荷诱导的小鼠从心肌肥厚到心力衰竭的发展过程"。我们对该论文进行了研读,并就文中解释心肌肥厚发生机制的不合理之处提出了自己的见解。撰写的Letter于2009年5月17日发表在《J Clin Invest官方网站上。

钙信号早期干预对大鼠心肌细胞钙调素依赖性蛋白激酶信号途径及细胞凋亡的影响

通过建立肥大心肌细胞模型,研究钙通道阻滞剂对心肌细胞钙调素依赖性蛋白激酶II(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKII)的表达及钙离子浓度的变化对钙泵、ATP凋亡信号调节激酶(apoptosis signal-regulation kinase1 ASK1)、细胞活力及细胞凋亡率的影响,深入了解钙离子拮抗剂在心肌细胞肥大过程中的作用。通过早期应用钙离子拮抗剂,可以明显改善CaMKII信号系统的活性,保持心肌细胞内钙稳态,抑制心肌细胞的凋亡。

运动提高糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4基因表达的信号机制

为研究运动激活的CaMK II对糖尿病大鼠骨骼肌MEF2和GLUT4结合活性及GLUT4基因表达量的调节作用,以了解运动提高糖尿病大鼠GLUT4基因表达的可能机制。将健康SD大鼠100只,40只作为正常对照,其余60只建立糖尿病大鼠模型,建模成功35只。正常对照和糖尿病大鼠再按体重各自随机分为5组:安静对照组、一次性运动组、一次性运动+KN93组、耐力训练组、耐力训练+KN93组,共10组。跑台速度20 m/min,运动时间1 h。一次性运动组大鼠1次运动后3 h取材。耐力训练组采用同样跑台速度和运动时间,训练1周,并于最后1次训练后12 h取材。结果得到,糖尿病大鼠耐力训练组,骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4的结合活性及骨骼肌GLUT4基因表达量虽然均显著低于正常对照大鼠耐力训练组,但与糖尿病大鼠安静对照组相比均显著升高;耐力训练+KN93组,骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4的结合活性与安静对照组相比差异没有显著性,但骨骼肌GLUT4基因表达量与安静对照组相比却显著升高。结果显示:虽然运动通过激活糖尿病大鼠骨骼肌CAMK II而提高其骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4的结合活性,虽然MEF2和GLUT4的结合活性参与调解了正常大鼠骨骼肌GLUT4基因表达,但并不是影响糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4基因表达的唯一因素。

钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ在心肾综合征中的作用

钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK)是健康与疾病中钙离子信号传导的重要调节因子。钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是其最丰富的亚型,主要分布于心脏,通常被认为是兴奋收缩偶联的调节因子。然而,最近的研究表明,其也可以介导心血管疾病(CVD)的炎症。随着全球心血管疾病合并肾脏疾病的发病率越来越高,心肾综合征(CRS)已经成为一个迫切需要解决的问题。虽然CaMKⅡ对心脏的重要性众所周知,但是CaMKⅡ对CRS的作用却知之甚少。现通过使用PubMed数据库进行广泛文献检索,旨在讨论CaMKⅡ作为一种炎症介质在心脏和肾脏两个脏器之间的相互作用。

αCaMKII在前脑过量表达损伤小鼠灵活性学习能力

将3月龄实验小鼠分为αCaMKII-F89G转基因组和同窝野生对照组,进行疲劳转棒实验和Morris水迷宫实验测试.结果显示,转基因组小鼠的体力和运动协调能力与对照组相比无显著的差异;在Morris水迷宫实验的可视平台测试中,转基因鼠的视觉和求生的动机表现正常;在定位航行训练和第一次空间探索测试中,两组鼠在训练时逃避潜伏期及测试中在目标象限探索时间无统计学差异;但是在反向定位空间学习阶段,转基因组在第二、三天逃避潜伏期和距离明显长于同窝对照组(P<0.05).由此认为,αCaMKII在前脑过量表达对小鼠的灵活性学习有损伤作用,推测这种损伤有可能由前脑LTD的缺陷造成的.

RNA干扰技术对PC12细胞CaMKⅡβ基因表达的影响

观察RNA干扰表达载体对PC12细胞中CaMKⅡβ基因的抑制作用。构建针对CaMKⅡβ基因的RNAi质粒表达载体,脂质体法转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测其对CaMKⅡβ mRNA及蛋白质水平的影响。构建的质粒表达载体在PC12细胞中抑制了CaMKⅡβ mRNA及蛋白质的表达。与阴性对照组相比,表达质粒产生的siRNA对CaMKⅡβ mRNA的抑制率48h,72h分别为46.40%,64.69%,蛋白抑制率72h约为74.77%。RNAi表达载体可以有效地抑制PC12细胞CaMKⅡβ基因的表达。

CaMKII介导20-HETE诱导的乳鼠心肌细胞凋亡作用机制研究

目的研究20-羟二十烷四烯酸(20-HETE)对培养乳鼠心肌细胞凋亡的作用,并探究其中的机制。方法体外培养乳鼠心肌细胞,采用CCK-8法检测细胞活性,TUNEL法检测凋亡;Fluo-3/AM荧光探针检测心肌细胞内钙离子浓度([Ca^(2+)]i)。应用Western Blot检测Ry R2、SERCA2a、Ca MKII及其磷酸化蛋白表达。结果20-HETE可明显降低心肌细胞活性、诱导细胞凋亡,而加入Ca MKII抑制剂KN-93可阻断20-HETE的作用;20-HETE可显著增加心肌细胞内[Ca^(2+)]i,上调Ry R2蛋白表达,并下调SERCA2a蛋白表达,这些作用可被KN-93所阻断;20-HETE促进了心肌细胞Ca MKII蛋白以及磷酸化Ca MKII表达,具有激活Ca MKII信号通路作用。结论20-HETE通过激活Ca MKII信号通路引起肌浆网Ca^(2+)转运蛋白Ry R2和SERCA2a功能改变,导致细胞钙超载,诱导心肌细胞凋亡。