基于碳量子点-银纳米簇荧光共振能量转移纳米探针的荧光传感器检测转基因成分CaMV35S

利用荧光共振能量转移(FRET)纳米探针结合催化发夹组装(CHA)无酶扩增信号放大途径建立了一种可用于转基因成分的荧光检测方法。首先为CaMV35S目标序列(tDNA)设计了可诱导的CHA循环的两个发夹结构序列HP1和HP2。当单链DNA标记碳点(sDNA-CDs)和DNA模板化银纳米团簇(Ts-AgNCs)杂交后,AgNCs和碳量子点(CDs)靠近,形成FRET效应,得到sDNA-CDs/Ts-AgNCs荧光猝灭的比率荧光探针。当tDNA存在时,通过杂交反应打开HP1发夹,形成HP1-tDNA双链结构;该结构可将HP2的发夹结构打开,从而形成HP1-HP2双链结构,同时释放出tDNA进入下一轮杂交,触发CHA循环。由于HP1-HP2中HP1的部分序列与Ts部分序列间的亲和性较sDNA强,因此,加入sDNA-CDs/Ts-AgNCs后,sDNA-CDs从探针中释放,使CDs(λem=464 nm)的荧光得以增强。而AgNCs仍在双链结构中,其荧光强度(λem=560 nm)基本保持不变。以IF464/IF560为检测信号,在最优条件下,该比率荧光传感器对CaMV35S检测的线性范围为0.1~50 nmol/L,检出限(LOD,S/N=3)为0.02 nmol/L。制备的传感器具有良好的选择性,将该传感器用于转基因番茄叶中CaMV35S成分的检测,结果可靠。

转基因大豆外源基因CaMV35S启动子测定不确定度分析

为了了解转基因成分定量分析结果不确定度的主要贡献因素,提高转基因成分定量检测质量,本文对转基因大豆GTS40-3-2粉末样品进行了CaMV35S启动子(参数)含量测定,对其测量不确定度进行了初步估算。CaMV35S启动子测量不确定度评定结果:A类不确定度(uA)为0.0004,B类不确定度(uB)为0.002,合成不确定度(uc)为0.002;在置信水准(p)95%时,包含因子(k)取1.96,扩展不确定度(U)为0.004。本次测量结果(C)为0.028±0.004,接近约定真值(0.03),测量不确定度相对较小,检测质量较高。不确定度评估表明试验中的微量液体转移偏差是本次测量不确定度的主要贡献者,在以后的检测中应重点注意降低微量液体转移的偏差,提高检测质量。

CaMV35S双启动子显著提高转基因在拟南芥中表达水平的研究(简报)

以大肠杆菌 (E .coli)UidA为报道基因定量研究CaMV35S双启动子在拟南芥中的表达强度表明 ,35S双启动子的平均表达强度比 35S启动子高

大豆样品中DNA的提取与外源基因CaMV35S的PCR检测

采用试剂盒从大豆样品中成功提取出DNA,对花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了电泳检测,建立了提取大豆DNA与CaMV35S启动子PCR检测的方法,对实验操作中的问题进行了探讨.

CaMV35S启动子及其在转基因作物中的应用和检测

花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)是植物基因工程中应用最广泛的启动子之一,它在转基因植物的安全评价及检测研究中具有重要意义。了解CaMV35S启动子的起源及其发展情况,是开展转基因安全评价和检测的前提。文章对CaMV35S启动子的发展历史及其结构、功能作了简要描述,分析总结了CaMV35S启动子在转基因作物中的应用情况和目前对其相应的检测方法。针对目前在转基因作物中检测CaMV35S启动子存在的问题,认为今后转基因相关作物的序列信息及检测数据需要交流和共享,同时各个检测机构或实验室之间需要展开数据共享与共同验证,从而建立针对CaMV35S启动子的相对统一的标准检测方法。

抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法的建立与应用

应用PCR检测方法 ,以大豆凝集素 (lectin)基因为内置标准 ,检测了抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4 EPSPS成分 ,并通过Southern杂交进一步证实了PCR检测结果的可靠性 ,建立了基于PCR的抗草甘膦转基因大豆检测方法 ,最低检测限度为 0 .0 5 %。用此方法检测转基因情况未知 ,分别来自欧盟、美国、阿根廷、未知国别的进口大豆及未知国别的进口豆粕 ,除从欧盟进口的大豆无CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4 EPSPS基因成分外 ,其余样品均含有上述成分 ;而从国内非转基因大豆中未检出上述成分。用此方法检测抗草甘膦大豆京引D1×豫豆 12的F2 和F2∶5群体植株 ,PCR检测结果与大田施药 (草甘膦有效成分 1.0kg·ha-1)检测结果一致率分别达 10 0 %和 93.0 %。

9种大豆制品中转基因成分定性PCR检测

本研究从豆粕、豆粉、豆腐等9种大豆产品中提取到高质量的DNA,在对内标准基因Lectin进行扩增的基础上,设计相应的特异性引物,建立了稳定的定性PCR反应体系,对35S启动子基因、外源目的基因Cp4-epsps基因进行了扩增,发现豆粕、豆奶粉、豆腐、豆皮、豆豉中含有转基因成分,而其它产品中未发现转基因成分存在。

用绿色荧光蛋白和洋葱表皮细胞检测拟南芥rd29A基因启动子活性的方法

将rd29A基因的启动子与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合在一起,构建成植物表达载体,并以CaMV35S启动子驱动的GFP基因的植物表达载体为对照,用基因枪介导法转化置于4种类型培养基上的洋葱表皮细胞。对其进行不同温度下的培养,16h后观察GFP基因瞬时表达水平的结果表明,rd29A启动子对高盐和脱水逆境的响应较温度显著,特别是在含PEG6000的培养基上,细胞无破损,绿色荧光强烈,适合于GFP的瞬时表达。而高盐由于易导致细胞出现离子毒害,不宜作为GFP瞬时表达的培养基。

转基因玉米的定性PCR检测

根据玉米内参照基因zSSIIb和转基因玉米中常见的CaMV35S、NOS、Bt、hpt等基因的特异性结构,设计5对定性PCR引物,经定性PCR检测,可以准确地将转基因玉米的目的基因检出,说明这5对引物具有较高的特异性和准确性。由此建立了一套转基因玉米定性PCR检测方法,用于转基因玉米及其产品的筛查、抽检。

乙型肝炎病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达

目的提高乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）在人参愈伤组织细胞中的表达。方法构建一种植物细胞表达载体pBIBeo,该载体携带CaMV 35S双增强启动子和TMV（U1株）翻译增强子。用pBIBeo转化的农杆菌LBA4404与人参愈伤组织细胞共培养,经G418筛选获得新生抗性细胞团PBIBeo,连续继代培养选育出用于植物源口服乙肝疫苗生产的高产细胞株。提取基因组DNA和mRNA,进行PCR和RT-PCR鉴定,Western blot鉴定HBsAg的特异性,电镜下观察纯化抗原颗粒大小,并以ELISA检测HBsAg的表达水平。结果转化的人参细胞基因组DNA进行PCR反应,得到约700 bp的启动子基因片段。提取mRNA进行RT-PCR反应,得到约700 bp的HBsAg基因片段。Western blot分析可见相对分子质量为24 000的特异性条带。亲和层析纯化细胞表达的HBsAg抗原,电镜观察可见平均直径为32 nm的颗粒。ELISA检测结果表明pBIBeo转化细胞株HBsAg表达量比pBIBSa转化细胞株提高1~2倍。结论人参细胞基因组已经整合了目的基因并稳定高效表达。

硒化铅纳米粒子DNA电化学传感器检测花椰菜花叶病毒35S启动子基因序列

以水热法合成十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)修饰的PbSe纳米粒子。在碳糊电极表面制备的PbSe纳米粒子壳聚糖(CHIT)复合膜上,实现了DNA的固定和杂交,并用循环伏安法和电化学交流阻抗法进行了表征。应用电活性分子亚甲紫(MV)作为杂交指示剂,以微分脉冲伏安法对转基因植物CaMV35S启动子基因片段进行测定,检测范围为5.0×10-11～5.0×10-6mol/L;检出限为1.6×10-11mol/L(3σ)。该传感器能很好地识别DNA互补序列、非互补序列和2碱基错配序列。

两种启动子调控下的CBF4基因植物表达载体的构建

目的:构建由组成型启动子CaMV35s和诱导型启动子CBF4P调控的转录因子CBF4基因的两个植物表达载体。方法:用EcoRⅠ酶将CBF4和CBF4P两个基因切下,连接到BluescriptM13(SK)上,分别构建成两个中间载体SK-CBF4和SK-CBF4P,再利用SK上的多克隆位点与植物表达载体p3301上相同的酶切位点,将CBF4和CBF4P连接到植物表达载体p3301上,分别构建了由组成型启动子CaMV35s和诱导型启动子CBF4P调控的转录因子CBF4基因的两个植物表达载体p3301-CBF4和p3301-CBF4P。结果:用PCR扩增重组质粒p3301-CBF4和p3301-CBF4P,分别得到了670bp和1200bp的特异性片段。酶切检测也分别得到了与预期结果一致的DNA片段。结论:所构建的两个表达载体均正确,可用于植物遗传改良和两种启动子的启动效率的研究。

进口转基因抗Basta^(TM)除草剂油菜籽检测方法研究

建立了从油菜籽中提取总ＤＮＡ和用ＰＣＲ技术检测外源基因的方法，用该方法从进口油 菜籽中检出外源的草丁膦乙酰转移酶基因（ＰＡＴ）、新霉素磷酸转移酶基因（ＮｐｔＩＩ）、花椰 菜花叶病毒３５Ｓ启动子（ＣａＭＶ ３５Ｓ）。

Kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体的构建

目的 :构建含有目的基因kringle5的真核植物细胞穿梭表达载体。方法 :应用RT PCR方法 ,从正常人肝脏组织中获得kringle 5基因 ,测序后 ,再通过DNA重组技术 ,将kringle 5基因片段克隆到真核植物细胞表达载体pBI12 1和pCAMBIA330 1上。结果 :得到的kringle 5基因序列测定结果与文献相符 ,重组载体pB1k5和pC33k5经酶切鉴定正确 ,含有植物高效表达CaMV35S启动子。结论 :重组载体pB1k5和pC33k5不仅可以在大肠杆菌中稳定复制 。

多聚酶对转基因产品PCR检测的影响分析

本文参考出入境检验检疫行业标准中转基因油菜外源基因的PCR检测体系,分析了18种不同DNA聚合酶对定性PCR检测转基因油菜OXY235中的CaMV35S启动子的影响。结果表明,不同DNA聚合酶对CaMV35S启动子定性PCR检测中非特异扩增的产生以及检测灵敏度影响较大。其中热启动Taq酶效果较好,目标条带清晰,检测灵敏度高,而且完全没有非特异性扩增条带,非常适合用于定性PCR检测。对于同样条件下无法有效扩增0.1%DNA样品的Taq酶,则不推荐用于检测途径。

大麦核糖体失活蛋白基因与天花粉蛋白基因双价植物表达载体的构建

大麦核糖体失活蛋白(B-RIP)和天花粉蛋白(TCS)均具有广谱抗病毒作用,研究构建了分别由2×CaMV35S启动子调控的大麦核糖体失活基因(rip)和天花粉蛋白基因(tcs)双价植物表达载体pABTR,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ),适用于双子叶植物的遗传转化。并通过三亲本杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为通过农杆菌介导法将双价基因导入植物,培育理想的抗病毒转基因植物奠定基础。

一个新的编码大豆DREB转录因子基因的克隆及鉴定

DREB转录因子是一类可以调控多个与干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达的转录因子家族。从大豆耐盐品种铁丰8号中克隆了一个新的DREB基因GmDREB5。该基因编码309个氨基酸,具有典型的AP2/EREBP保守结构域,属于AP2/EREBP类转录因子中的DREB亚族。同源性比较分析表明,GmDREB5基因与Genbank登录的DREB基因同源性不高,属于新基因。酵母转录激活实验证明,该基因可以与DRE顺式作用元件特异结合,并具有转录激活活性;同时采用CaMV35S启动子驱动,构建了植物表达载体pBI35S-GmDREB5,并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中,再利用叶盘转化法将重组质粒导入烟草品种W38中,获得转基因烟草植株30株。

番茄果实特异性LYC-B干扰载体的构建及在不同颜色果实中的表达特异性验证

为了研究番茄LYC-B 干扰对类胡萝卜素合成主要酶和主要代谢产物的影响,构建了果实特异性的番茄红素β- 环化酶LYC-B 干扰载体,并验证了其在不同颜色番茄果实中的有效性.依据X13437.1 扩增番茄果实特异启动子E8,构建了果实特异性载体E8-pBI121,其在粉色、红色、绿色和紫色的番茄果实中均能表达.依据X86452.1 扩增番茄LYC-B 从61～861bp 间长度为801 bp 的片段LYC-B1 和从 480～781 bp 间长度为302 bp 的片段 LYC-B2,构建了以CaMV 35S 为启动子的LYC-B干扰表达载体pBI121-B1B2,以E8 替换CaMV 35S,构建了果实特异性干扰载体E8-pBI121-B1B2.采用农杆菌注射法分别侵染番茄叶片和果实,GUS 染色显示,pBI121-B1B2 在叶片、果实和种子中均表达,E8-pBI121-B1B2 只在果实和种子中表达.

广州市售豆制品转基因成分的检测与分析

为了解广州市市售豆制品的转基因情况,对广州市售散装豆制品和预包装豆制品分别进行抽样检验。采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取大豆DNA,利用核酸定性PCR、实时荧光PCR及环介导等温扩增技术(LAMP)对外源基因Ca MV35S,NOS和EPSPS进行检测。调查共抽检豆制品207份,研究结果表明,在检测的159份散装豆制品中,87份检出转基因成分;在48份预包装豆制品中,18份检出转基因成分。散装豆制品无任何食品标签,而预包装豆制品均无转基因食品标识。

浙江省转基因大豆、玉米和番茄的检测调查

食品安全与其原料息息相关,为给政府监管提供依据,同时维护消费者的知情权,转基因作物是目前食品安全的热点之一。本研究从大豆、玉米和番茄中提取到高质量的DNA,在分别对大豆内标准基因Lectin、玉米内标基因IVR和番茄内标基因PG进行扩增的基础上,设计相应的特异性引物,建立了稳定的定性PCR反应体系,对CaMV35S启动子基因进行了扩增,结果表明,浙江省市场上大豆转基因阳性机率占57%,玉米和番茄转基因阳性机率各占43%。