转基因大豆外源基因CaMV35S启动子测定不确定度分析

为了了解转基因成分定量分析结果不确定度的主要贡献因素,提高转基因成分定量检测质量,本文对转基因大豆GTS40-3-2粉末样品进行了CaMV35S启动子(参数)含量测定,对其测量不确定度进行了初步估算。CaMV35S启动子测量不确定度评定结果:A类不确定度(uA)为0.0004,B类不确定度(uB)为0.002,合成不确定度(uc)为0.002;在置信水准(p)95%时,包含因子(k)取1.96,扩展不确定度(U)为0.004。本次测量结果(C)为0.028±0.004,接近约定真值(0.03),测量不确定度相对较小,检测质量较高。不确定度评估表明试验中的微量液体转移偏差是本次测量不确定度的主要贡献者,在以后的检测中应重点注意降低微量液体转移的偏差,提高检测质量。

CaMV35S启动子及其在转基因作物中的应用和检测

花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)是植物基因工程中应用最广泛的启动子之一,它在转基因植物的安全评价及检测研究中具有重要意义。了解CaMV35S启动子的起源及其发展情况,是开展转基因安全评价和检测的前提。文章对CaMV35S启动子的发展历史及其结构、功能作了简要描述,分析总结了CaMV35S启动子在转基因作物中的应用情况和目前对其相应的检测方法。针对目前在转基因作物中检测CaMV35S启动子存在的问题,认为今后转基因相关作物的序列信息及检测数据需要交流和共享,同时各个检测机构或实验室之间需要展开数据共享与共同验证,从而建立针对CaMV35S启动子的相对统一的标准检测方法。

CaMV35S启动子驱动的FT基因调控杨树早期开花的初步研究

为了研究CaMV35S启动子驱动的FT基因对转基因杨树Populus早期开花的影响,利用Gateway技术构建了35S∷FT基因表达载体,并对杨树进行了遗传转化,从转基因杨树花的发育、花器官变异等方面初步探讨了35S∷FT促进杨树早期开花性能.结果表明：35S∷FT转基因杨树分生组织属性的改变及初始花结构的形成发生于试管培养阶段;花开始发育后如不及时把开花植株继代培养或转至土壤温室培养,初始花结构会凋谢枯萎,不能继续发育.转基因植株花器官的分化与发育发生于温室培养阶段的3～5周内,能够分化出典型的花器官,但发育不完全,具雌雄蕊、花盘结构,无成熟苞片结构,雄蕊不能成熟发育.35S∷FT诱导的花均为单朵花,而非野生型的柔荑花序;多数花属于单性花,但转基因雄性无性系中会出现两性花.转基因植株的开花率随着试管苗继代次数的增加而急剧下降,但两性花比例会上升.

花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子在转基因棉花中的表达

利用GUS作为报告基因 ,通过GUS组织化学定位法检测棉花转化愈伤组织、体细胞胚 ,R0 代棉花根、茎、叶、花器官以及正在发育的胚GUS基因表达情况 ,详细阐述了CaMV 3 5S启动子在棉花细胞中的表达轮廓。结果表明 ,在愈伤组织细胞有丝分裂和增殖过程中GUS基因能稳定表达并遗传给后代细胞 ;在根、茎、叶细胞中检测到GUS表达活性。在胚胎发育过程中 ,最早检测到GUS表达活性的为开花 1 1d的鱼雷胚和胚乳。随着胚胎的发育 ,GUS表达活性逐渐增强并扩展到子叶微管组织 ,表明CaMV 3 5S启动子是随着胚胎发育进程被逐渐调节的。在花粉和特殊的纤维细胞中 ,也检测到GUS的表达活性。资料证明 ,该启动子在棉花不同发育时期的大部分组织和细胞中都是表达的。

CaMV35S双启动子显著提高转基因在拟南芥中表达水平的研究(简报)

以大肠杆菌 (E .coli)UidA为报道基因定量研究CaMV35S双启动子在拟南芥中的表达强度表明 ,35S双启动子的平均表达强度比 35S启动子高

CaMV 35S启动子在菊花中驱动GUS外源基因的表达分析

[目的]由于CaMV 35S启动子转化菊花存在外源基因表达量低、基因沉默等问题,本研究对35S启动子、2×35S启动子在菊花中驱动GUS外源基因的表达进行了分析,以期为高效菊花转化提供理论指导。[方法]通过设计引物,利用PCR从p CAMBIA1301 Vector中克隆了35S启动子、2×35S启动子的序列并插入pORE R2载体中,分别获得了重组载体p ORE R2-35S:GUS和p ORE R2-2×35S:GUS,通过农杆菌介导法将构建的遗传转化载体分别导入切花菊品种‘神马’中。[结果]试验共转化2 296个菊花叶盘,经过筛选共得到16个过量表达的转基因株系。经PCR验证,目标片段已经成功插入转基因株系基因组。荧光定量PCR分析和染色分析显示,在转基因菊花中2×35S比35S启动子表现出驱动GUS基因高量表达的特性。[结论]在选择合适菊花品种的基础上,2×35S比35S启动子可以更加高效地促进基因表达。

转基因产品CaMV 35S启动子基因实时荧光PCR检测方法中引物探针序列特征及影响

[目的]分析不同标准方法中CaMV 35S启动子基因筛查方法中引物探针位置关系,讨论以引物探针序列重组为阳性对照样品的可行性。[方法]收集国内标准方法中CaMV 35S启动子基因检测引物探针序列与CaMV参考序列比较,确定其引物探针位置特点。设计不同长度间隔序列的串联引物探针重组序列,检测其结果差别。[结果]CaMV 35S启动子基因实时荧光PCR检测方法中引物与探针区间隔序列对扩增结果影响甚微。[结论]通过将引物探针序列顺序串联合成重组序列可以作为特定实时荧光PCR检测方法的阳性对照。

35S启动子甲基化引起棉花转基因沉默(英文)

用带PBI121质粒的农杆菌LBA4404菌株转化泗棉3号胚性愈伤组织,获得的再生植株进一步对gus和nptⅡ基因进行PCR跟踪检测,共得到97株阳性转基因植株。GUS组织化学检测发现,97株转基因幼苗中有10株GUS检测阴性,嫁接后,只成活一株。利用来源于同一愈伤系的GUS检测阳性植株作为对照,对这一GUS检测阴性的植株进行gus基因沉默机理研究。Southern分析表明,该GUS检测阴性植株与GUS检测阳性植株有相同拷贝数。GUS组织化学检测和RT-PCR分析显示,gus基因在GUS检测阴性植株中没有表达,而nptⅡ基因在这两株转基因棉花中都表达。用限制性内切酶-PCR法分析35S启动子区甲基化发现:GUS检测阴性植株35S启动子区TATA box的HapII/MspI酶切位点发生甲基化,而GUS检测阳性植株该位点没有甲基化。以上研究表明,这株gus沉默的转基因棉花可能是由于其35S启动子区甲基化引起的。

转基因抗草甘膦油菜籽中FMV 35S启动子的检测研究

对 FMV3 5 S和 FMV3 4S、Ca MV3 5 S启动子的 DNA序列进行了同源性分析 ,并设计引物对转基因抗草甘膦油菜籽中转入的 FMV3 5 S启动子进行了检测 .从 7船进口加拿大油菜籽检出 FMV3 5 S启动子基因 .

含35S启动子的粟酒裂殖酵母表达载体的构建及功能鉴定

利用PCR技术从植物表达载体pBI121上先后克隆出GUS基因和35S-GUS-NOS基因序列,分别构建粟酒裂殖酵母重组表达载体pESP-2-GUS和pESP-2-35S.GUS.NOS,并将它们转化到粟酒裂殖酵母菌体中。通过对不同液体培养基中两种转化子的不同启动子启动GUS基因表达产物的GUS染色分析与比较,证明连入的35S启动子能够替代pESP-2自身受维生素B1浓度调控的启动子,从而降低了培养基的成本,为今后工业上利用粟酒裂殖酵母发酵生产产品,提高经济效益,奠定了基础。

硒化铅纳米粒子DNA电化学传感器检测花椰菜花叶病毒35S启动子基因序列

以水热法合成十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)修饰的PbSe纳米粒子。在碳糊电极表面制备的PbSe纳米粒子壳聚糖(CHIT)复合膜上,实现了DNA的固定和杂交,并用循环伏安法和电化学交流阻抗法进行了表征。应用电活性分子亚甲紫(MV)作为杂交指示剂,以微分脉冲伏安法对转基因植物CaMV35S启动子基因片段进行测定,检测范围为5.0×10-11～5.0×10-6mol/L;检出限为1.6×10-11mol/L(3σ)。该传感器能很好地识别DNA互补序列、非互补序列和2碱基错配序列。

高灵敏度电化学发光PCR方法检测花椰菜花叶病毒35 S启动子

大多数转基因植物中使用花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV)35 S作为启动子,因此可通过检测该启动子来判断植物样品中是否含有转基因成分。实验将高灵敏度电化学发光PCR方法用于检测转基因烟草中的CaMV35 S启动子,将该启动子的PCR产物与生物素标记的探针杂交,可以起到特异性筛选产物的作用;与发光标记物——三联吡啶钌标记的探针杂交,从而实现电化学发光检测。两种探针同时与待测样品的PCR产物进行杂交,进一步对样品进行特异性筛选,从而提高了检测的准确性,避免了假阳性结果的产生。实验结果表明:该法可以准确的区分待测样品中是否含有35 S启动子,从而区别转基因烟草和非转基因烟草。电化学发光PCR方法灵敏度高,可靠性强,操作简便,结果准确,有望成为一种高效的转基因植物检测方法。

基于碳量子点-银纳米簇荧光共振能量转移纳米探针的荧光传感器检测转基因成分CaMV35S

利用荧光共振能量转移(FRET)纳米探针结合催化发夹组装(CHA)无酶扩增信号放大途径建立了一种可用于转基因成分的荧光检测方法。首先为CaMV35S目标序列(tDNA)设计了可诱导的CHA循环的两个发夹结构序列HP1和HP2。当单链DNA标记碳点(sDNA-CDs)和DNA模板化银纳米团簇(Ts-AgNCs)杂交后,AgNCs和碳量子点(CDs)靠近,形成FRET效应,得到sDNA-CDs/Ts-AgNCs荧光猝灭的比率荧光探针。当tDNA存在时,通过杂交反应打开HP1发夹,形成HP1-tDNA双链结构;该结构可将HP2的发夹结构打开,从而形成HP1-HP2双链结构,同时释放出tDNA进入下一轮杂交,触发CHA循环。由于HP1-HP2中HP1的部分序列与Ts部分序列间的亲和性较sDNA强,因此,加入sDNA-CDs/Ts-AgNCs后,sDNA-CDs从探针中释放,使CDs(λem=464 nm)的荧光得以增强。而AgNCs仍在双链结构中,其荧光强度(λem=560 nm)基本保持不变。以IF464/IF560为检测信号,在最优条件下,该比率荧光传感器对CaMV35S检测的线性范围为0.1~50 nmol/L,检出限(LOD,S/N=3)为0.02 nmol/L。制备的传感器具有良好的选择性,将该传感器用于转基因番茄叶中CaMV35S成分的检测,结果可靠。

35S启动子组入蓝藻质粒载体pUC13－pbl

３５Ｓ启动子组入蓝藻质粒载体ｐＵＣ１３－ｐｂｌ楼士林，郭奕斌，吴巧娟（生物学系）近年来构建了一些含３５Ｓ启动子的质粒载体￣［１］，但未见含３５Ｓ启动子的蓝藻质粒载体．因此本研究拟把ＣａＭＶ的３５Ｓ启动子组入由孙立春等人构建的蓝藻质粒载体ｐＵＣ１３－ｐ...

电化学DNA传感器制备及用于花椰菜花叶病毒35S启动子快速检测

[目的]构建一种新型DNA电化学传感器,并用于花椰菜花叶病毒35S启动子片段检测。[方法]通过使用氨基化多壁碳纳米管对玻碳电极进行修饰,利用氨基化多壁碳纳米管对硫堇-金纳米粒子-DNA纳米复合物的吸附固定得到用于识别目标DNA的捕获界面,并将亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子作为结构末端的信号分子,完成夹心结构传感器组装。试验采用循环伏安法对辣根过氧化物酶催化过氧化氢得到的还原电流进行测试。[结果]该传感器可实现对目标DNA定量检测,线性范围为1×10-18~1×10^(-11)mol/L,检测限低至6.95×10^(-20)mol/L,可特异性识别错配序列,并且表现出良好的重现性和稳定性。[结论]该传感器在转基因食品的检测方面有良好的应用前景。

不同启动子驱动下acdS基因转化烟草及耐盐性研究

acdS基因编码产生ACC脱氨酶,该酶属于脱巯基家族,可以降低逆境乙烯的合成量。利用农杆菌介导的叶盘法将CaMV35S-2启动子和rolD启动子驱动下的acdS基因转入烟草NC89叶片中。在含有卡那霉素的MS培养基上筛选得到Kanr转化烟草。通过PCR、Southern blotting对得到的Kanr转基因烟草进行分析,结果表明,acdS基因已经整合到了烟草的基因组中。对转基因烟草的RT-PCR及cDNA进行测序分析表明,acdS基因能够正确转录。对转基因烟草进行耐盐性测定,结果显示,与对照相比,两种启动子驱动下的转基因烟草耐盐性均有增强。但是rolD启动子驱动下的转基因植株的耐盐性最强。

SV40启动子在烟草体内的驱动特性研究

根据SV40启动子序列设计引物,PCR扩增该启动子后,成功构建了具有SV40启动子和GUS报告基因的植物表达载体pLpPSG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过SV40启动子驱动的GUS基因在烟草叶片内的瞬时性表达,研究了该启动子在植物基因表达中的驱动特性.结果表明:SV40启动子可启动GUS基因在烟草体内的表达,其提高基因表达水平达到2×35S启动子的(88.5±19.2)%.

大豆样品中DNA的提取与外源基因CaMV35S的PCR检测

采用试剂盒从大豆样品中成功提取出DNA,对花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了电泳检测,建立了提取大豆DNA与CaMV35S启动子PCR检测的方法,对实验操作中的问题进行了探讨.

Roundup Ready大豆中Lectin、CaMV 35S、NOS和CP4 EPSPS基因的提取与RT-PCR定性范围研究

[目的]研究Roundup Ready大豆的Lectin、CaMV35S、NOS和CP4EPSPS等被检测基因的RT-PCR定性范围。[方法]用CTAB法提取DNA,对Lectin、CaMV35S、NOS和CP4EPSPS等被检测基因的检测条件进行了优化,确定了被检测基因在相同RT-PCR条件下的定性范围。[结果]研究发现,不同被检测基因在相同RT-PCR条件下的浓度检出范围不同。Lectin为0.05～792mg/L,CaMV35S为0.25～792mg/L,NOS为0.25～396mg/L,CP4EPSPS为0.05～1980mg/L;共同的方法检出限LOD为5ng,体系浓度范围为0.25～396mg/L。[结论]确定了Roundup Ready大豆被检测基因的定性范围和检出限,可应用于大豆中相关基因的检测。

小鼠液胞H^+-ATPase 15 K启动子(M15 K)的克隆及其在植物体内的表达特性研究

PCR克隆了小鼠液胞H+-ATPase 15K启动子,构建具有Kan抗性和GUS intron报告基因的植物表达载体LpPMG.通过M15K启动子指导的GUS intron基因在烟草叶片内的瞬时性表达,比较了其植物表达特性.结果表明:M15K启动子可启动GUS在植物体内的表达.其表达活性相当于2×35S启动子的87.0%±17.3%.