Cav1.2钙通道C末端远端片段dDCT重组质粒的构建及蛋白制备

目的构建Cav1.2钙通道C末端远端片段(dDCT)(2 080~2 169)质粒,表达、提取、纯化蛋白并进行生物学活性鉴定。方法将dDCT的cDNA片段插入pGEX-6p-1质粒载体并转化大肠杆菌,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导蛋白表达,超声破碎法提取蛋白。GS-4B beads纯化蛋白后,pull-down方法分析其生物学活性。结果构建的dDCT质粒经限制性内切酶和测序双重鉴定成功,经超声破碎法提取的dDCT蛋白纯度和浓度均较高,并具有能够与GST-CT1融合蛋白浓度依赖性结合的生物学活性。结论本研究成功构建了dDCT重组质粒,为深入探讨Cav1.2钙通道的自身调节机制奠定了重要的物质基础。

L型钙离子通道CaV1.2蛋白在大鼠七氟烷麻醉中的作用

目的探讨CaV1.2蛋白在七氟烷麻醉机制中的作用。方法 40只成年雄性SD大鼠,体重(200±20)g,随机分为5组(n=8):对照组(control)、七氟烷1h组(sevo1h)、七氟烷2h组(sevo2h)、七氟烷3h组(sevo3h)和七氟烷4组(sevo4h),大鼠七氟烷麻醉状态以翻正反射消失为监测指标,麻醉深度维持在1.5 MAC,麻醉时间分别为1h、2h、3h、4h。麻醉结束后行大脑皮层HE染色观察神经细胞形态学,Western blot、免疫组化检测CaV1.2蛋白改变。结果各组大鼠给予1.5 MAC的七氟烷麻醉,麻醉诱导时间(翻正反射消失的时间)、呼吸、心率和血压及动脉血pH值、PCO_2、PO_2和HCO_3^-差异均无统计学意义(P均>0.05)。HE染色结果显示大脑皮层神经细胞无形态学改变,说明1.5MAC七氟烷麻醉1~4h没有造成神经细胞损伤。与control组相比,随着七氟烷麻醉时间的延长,大鼠大脑皮层区CaV1.2阳性细胞表达率和CaV1.2蛋白表达量逐渐降低(P<0.05);麻醉sevo4h组CaV1.2阳性细胞表达率低于control和sevo1h组(P均<0.05);sevo3h与sevo4h组大鼠大脑皮层组织中CaV1.2蛋白表达量均低于control组(P均<0.05),且sevo3h组高于sevo4h组(P<0.05)。结论 L型钙离子通道CaV1.2蛋白表达下调参与了七氟烷的麻醉作用。

Genistein通过影响Ca^(2+)/CaM/Cav1.2/CaMKⅡ信号通路抑制Aβ_(25-35)诱导的海马神经元损伤

目的探讨植物雌激素染料木素(Genistein,GST)对Aβ25-35引起海马神经元钙超载损伤的抑制作用及其机制。方法本实验分为以下4组:正常对照组,Aβ25-35组,Aβ25-35+Genistein组(Aβ25-35+GST组),Aβ25-35+17β-雌二醇组(Aβ25-35+E2组),通过MTT比色法测定细胞活性,选取Genistein的最适浓度。采用Aβ25-35处理建立海马神经元损伤模型。利用Tuj1染色观察神经元生长状态,激光共聚焦扫描观察Genistein对[Ca2+]i的影响,通过Western blot技术检测Ca M、Cav1.2、p-Ca MKⅡ/Ca MKⅡ蛋白表达的变化。结果 0.3μg/ml Genistein能明显抑制Aβ25-35引起细胞活性降低及[Ca2+]i增加,并能对抗Aβ25-35引起的Ca M,Cav1.2蛋白水平增加及p-Ca MKⅡ减少。结论 Genistein具有拮抗Aβ25-35所致海马神经元钙超载损伤的作用,其作用机制可能与Ca2+/Ca M/Cav1.2/Ca MKⅡ信号通路有关,为Genistein进一步应用于临床治疗神经退变性疾病提供理论依据。

间质作用因子1通过正调控窖蛋白1抑制FBJ-S1-H的迁移性

目的证明间质作用因子(stromal interaction molecule1,Stim1)在FBJ诱导的小鼠骨肉瘤细胞中的抑癌作用。方法在Stim1高表达的FBJ-S1-H细胞采用Stim1以siRNA干扰技术得到Stim1沉默的几株S1-H单克隆细胞株,通过细胞行为学方法和RT-PCR技术对其mRNA进行研究,通过明胶酶谱法对细胞基质金属酶活性进行研究。结果通过细胞行为学方法证明,Stim1的沉默提高了细胞的迁移性,通过对mRNA表达的研究发现,Stim1沉默引起了多种基因表达的变化,其中包括基质金属酶9(matrix mexalloprotelnase 9,MMP-9)的升高,窖蛋白(caveolinl,Cav1),甾醇调控因子Srebf1的降低等,提高单克隆细胞中的Cav1含量可以使细胞迁移性降低。结论实验结果证明在FBJ-S1-H细胞中,Stim1能够抑制细胞的移动性,沉默Stim1的表达能够提高细胞的迁移性。

庆大霉素对内毛细胞带状突触CaV1.3钙离子通道蛋白表达的影响

目的:研究庆大霉素对C57BL/6J小鼠听力及耳蜗内毛细胞带状突触CaV1.3钙通道蛋白数量的影响,探讨听力损失与其剂量相关性变化之间的关系及意义。方法:采用固定剂量[100mg/(kg·d)]的氨基苷类抗生素(庆大霉素)对C57BL/6J小鼠每日进行腹腔注射造模,分别在注射后的第7天、第14天、第28天(注射14d停药14d)应用ABR分别测得小鼠的听力。免疫荧光方法观察耳蜗基膜内毛细胞带状突触CaV1.3钙通道蛋白的分布和表达(其中0天为空白对照组),内毛细胞突触前后膜分别采用CtbP2和CaV1.3进行免疫荧光标记。结果:随着注射药物天数的增长ABR反应阈值明显提高,所有小鼠内毛细胞数量、形态均无明显变化,但内毛细胞带状突触CaV1.3钙离子通道蛋白量的表达存在显著差异(P<0.01)。CaV1.3钙离子通道蛋白在庆大霉素腹腔注射CaV1.3/CtBP2表达数量在第7天时略有增加,在第14天时其表达数量明显减少,第28天与第14天比较CaV1.3/CtBP2表达数量有所增加,但低于正常。结论:在氨基苷类抗生素毒性环境中耳蜗内毛细胞CaV1.3蛋白表现为先增加后减少再增加的趋势,提示内毛细胞带状突触CaV1.3蛋白数量的增加可能存在对这类药物毒性的代偿作用,而随着药物毒性作用时间的增加,这种失代偿作用表现为听力下降,可能是损伤听力的机制之一。

蛇床子素对L-和N-型钙通道的影响

目的:比较蛇床子素对不同钙通道亚型的作用差异方法:首先在tsA201细胞上瞬时转染Cav1.2,Cav1.3,Cav2.2e[37a],和Cav2.2e[37b]通道,然后采用全细胞膜片钳技术,记录tsA201细胞上的钙电流,并观察蛇床子素对各种钙通道亚型的影响结果:蛇床子素可以浓度依赖性抑制Cav1.2和Cav1.3电流,抑制的半有效浓度分别为162.1μmol·L^(-1)和56.2μmol·L^(-1)。此外,蛇床子素对Cav2.2通道也有一定的抑制作用,在300μmol·L^(-1)的浓度下,抑制38%的Cav2.2e[37a]电流和61%的Cav2.2e[37b]电流蛇床子素对钙电流的抑制是快速可逆的蛇床子素在各个测试电位水平均能抑制上述四种钙通道电流,但不改变电流的激活阈值和最大峰值电流的激活电压。

中国四川地区汉族人CACNA1S基因11号外显子单核苷酸多态性与甲状腺毒性低钾周期性麻痹的关系

研究CACNA1S基因11号外显子单核苷酸多态性与甲状腺毒性低钾周期性麻痹发病的关系。收集中国四川地区汉族人群中散发甲状腺毒性低钾周期性麻痹(THPP)男性患者22例,非甲状腺毒性低钾周期性麻痹(HPP)男性患者23例,男性甲状腺毒症不伴有低钾周期性麻痹(NTHPP)患者33例以及正常对照(NC)22例。采用PCR和DNA测序技术,分别对四组人群进行CACNA1S基因11号外显子单核苷酸多态性研究,比较各组基因型及等位基因的频率。同时检索数据库包括Cochrane图书馆临床对照试验注册中心CCTR(2009年第1期)、MEDLINE(1950-2009)及EMBASE(1950-2009),纳入相关文献进行Meta-分析。四川地区汉族男性人群CAC-NA1S基因11号外显子C1491T、T1551C和C1564T均存在单核苷酸多态性,其中C1491T和T1551C包含纯合体和杂合体的变异,C1564T无纯合体变异。1491位点和1551位点的小频率等位基因T和C的频率在THPP组中表现出升高的趋势,但差异无统计学意义(显性模型:P=0.563和P=0.568;等位基因模型:P=0.530和P=0.568)。Meta-分析结果显示,不同种族人群CACNA1S基因11号外显子C1491T、T1551C和C1564T的多态性与THPP无明显相关性,其合并OR值分别为2.12(95%CI:0.80-5.60),2.90(95%CI:0.71-11.78)和1.61(95%CI:0.36-7.26)。提示四川地区汉族男性人群CACNA1S基因11号外显子C1491T、T1551C和C1564T存在单核苷酸多态性,但这些单核苷酸多态性可能与甲状腺低钾周期性麻痹的发病无明显相关性。

动物3种DNA病毒在宿主细胞内形态发生比较

对猪细小病毒(PPV)、牛疱疹病毒2型(BHV2)和犬腺病毒1型(CAV1)3种动物DNA病毒在宿主细胞内的增殖、释放方式以及所致细胞结构的变化,通过电镜进行了观察比较.(1)这3种动物DNA病毒的复制和装配过程均发生在细胞核内,以毒浆结构(Viroplast)或核内包涵体为增殖场所和物质基础,但并非都形成结晶样结构.(2)有囊膜的BHV2,其核壳体在细胞核内装配完成后,从核内膜上以出芽方式获得囊膜,然后进入核周池,聚集的病毒使核外膜向胞质方向隆起,形成病毒性包涵体而脱离核外膜,并逐渐向细胞膜的方向移动,最后从细胞膜的破损处以病毒包涵体形式释放到细胞间隙.而无囊膜的CAV1,核壳体在细胞核内装配完成后,从细胞核膜破损处或细胞核崩解后进入细胞质,待整个细胞崩解后才能释放出来.无囊膜的PPV,在核壳体装配完成后,成堆地以病毒流的方式,从扩张的核孔释放到细胞质中,待细胞崩解后再释放出来.(3)3种病毒增殖时,宿主细胞的固有细胞器,如线粒体、内质网以及溶酶体等均出现不同程度的超微结构变化,并能诱导宿主细胞出现一些新的结构,除毒浆结构外,还有管状结构、细纤维样结构、周期性结构和髓膜样结构等,其中周期性结构仅见于BHV2感染.