幽门螺杆菌cagL基因缺失株的建立

目的:构建幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagL基因缺失株,为研究cagL基因的功能奠定基础。方法:利用同源重组原理,PCR扩增该基因编码区两侧序列,作为同源臂,构建出带卡那霉素抗性标志的载体,采用电穿孔法将其转化入受体菌中,并经PCR验证后获得了cagL基因缺失株;突变株和野生株分别与胃上皮细胞GES-1共培养后,检测其对CagA蛋白转运的影响。结果:构建cagL基因缺失的自杀质粒,并获得一株cagL基因缺失株;CagA转运实验表明,cagL基因缺失后,导致幽门螺杆菌CagA转运功能的丧失。结论:成功获得了幽门螺杆菌cagL基因缺失株,该基因参与CagA蛋白的转运,是该菌IV型分泌系统中重要组成成分之一。

重组表达幽门螺杆菌致病岛CagL蛋白及其中和抗体初步研究

目的重组表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)cagL基因,并制备兔抗多克隆抗体及阻断Hp黏附宿主细胞实验。方法用PCR方法扩增出cagL基因片段,将目的基因构建至表达载体pET22b中并诱导表达。采用亲和层析法纯化蛋白,以纯化蛋白为抗原免疫家兔,制备兔抗CagL多克隆抗体血清,并用多克隆抗体血清进行阻断Hp黏附宿主细胞实验及细胞因子IL-8活性分析。结果成功构建表达纯化了CagL重组蛋白,制备CagL蛋白兔抗多克隆血清,并初步验证了多克隆抗体血清在体外和Hp黏附作用的关系。与对照菌相比,重组菌CagL在25×103附近均出现新的蛋白表达条带,且诱导6 h时表达量最高。UVP扫描分析目的蛋白占菌体总蛋白的35%～40%。SDS-PAGE显示重组蛋白CagL主要以包涵体形式存在于超声沉淀中。ELISA结果显示兔抗CagL多克隆抗体的滴度为1∶16 000 EU。Giemsa染色后显微镜观察可见Hp菌与HeLa细胞呈典型的聚集性黏附,抗体中和后Hp与HeLa细胞未见黏附,加入DH5α的HeLa细胞也未见细菌黏附。结论多克隆抗体血清对Hp黏附定植有一定阻断作用,并且可以减少Hp促进细胞分泌IL-8的能力。

幽门螺杆菌CagL蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)CagL蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),并鉴定其特性。方法:用原核表达并纯化的CagL融合蛋白免疫BALB/c小鼠,6周后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经亚克隆筛选获得阳性杂交瘤细胞株;ELISA法鉴定mAb的亚型;间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清和腹腔积液效价及其相对亲和力;相加ELISA法分析mAb的识别表位;蛋白质印迹法鉴定mAb特异性;冻溶法检测杂交瘤细胞株的稳定性。结果:获得3株能稳定分泌抗CagL的杂交瘤细胞株,其中两株单抗属IgM类,一株单抗属IgG2a类,轻链型别均为κ型;杂交瘤细胞培养上清效价在1∶64～1∶128之间,腹腔积液的效价均达1∶16 000以上;相对亲和力较高;3株mAb识别3种不同的抗原表位;3株mAb都能与融合蛋白反应,其中两株能与H.pylori全菌蛋白发生特异性反应;杂交瘤细胞经冻存复苏后,体外传代仍能稳定分泌mAb。结论:成功制备了抗H.pylori CagL蛋白的单克隆抗体,为深入研究幽门螺杆菌CagL蛋白的功能和Ⅳ型分泌系统的致病机制奠定了基础。

幽门螺杆菌CagL变异体功能研究

目的：CagL作为幽门螺杆菌Cag- T4SS的一个基本组成部分，其通过RGD模体在胃上皮细胞内与整合素α5β1受体结合参与CagA的转运，本研究旨在探讨幽门螺杆菌CagL变异体的功能。方法：在这项研究中,通过组织学分析、体内外IL-8分泌检测、粘附实验和CagA转运实验被采用，发现一种新型的Ass57和Ass58缺失的CagL变异体，该变异体与野生型CagL的功能差别被研究。结果：野生型CagL幽门螺杆菌携带患者，其胃粘膜炎症细胞浸润程度高于CagL变异体携带者（3.20±0.80，1.63±0.32，=0.03）。野生型CagL幽门螺杆菌携带者，其胃粘膜IL-8水平高于CagL变异体携带者（141.57±29.77 pg/mg和104.96±21.50 pg/mg，〈0.01）。野生型CagL组GES-1细胞IL-8分泌含量高于CagL突变组（1544.87±112.61 pg/ml和1277.36±89.19 pg/ml，〈0.01）。CagL突变组的粘附活性低于CagL野生组[（11.38±1.04）×10^6和（16.70±1.47）×10^6，〈0.01）]，CagA的转运实验也出现了相似的结果。结论：我们发现新的CagL变异体可能是通过改变CagL三维结构的稳定性以减弱幽门螺杆菌的致病性。

幽门螺杆菌cagL氨基酸多态性与消化性溃疡及胃癌的关系

目的探讨幽门螺杆菌cagL氨基酸多态性与消化性溃疡及胃癌的关系。方法选取2015年2月至2016年10月在本院诊治的85例消化性溃疡病患者为消化性溃疡组,另选取同期于本院诊治的90例胃癌患者为胃癌组,选取同期于本院体检的74例健康人员为对照组。三组人员均幽门螺杆菌阳性。采集三组受试人员的胃活检标本提取DNA,经两对引物-聚合酶链式反应(PCR?CTPP)检测幽门螺杆菌cagL氨基酸D58、E59基因多态性,Hardy?weinberg遗传平衡定律验证两组基因型频率是否具有代表性;采用Logistic回归分析cagL氨基酸多态性与胃癌发生风险之间的关系;观察并分析其与胃癌患者临床病理参数的关系。结果 cagL在D58位点存在单核苷酸多态性,分别为野生型纯合子AA型、突变杂合子AG型、突变纯合子GG型;cagL在E59存在单核苷酸多态性,分别为野生型纯合子GG型、突变杂合子AG型、突变纯合子AA型;D58、E59基因多态性基因型频率分布符合Hardy?weinberg定律;与对照组、消化性溃疡组相比,cagL D58、E59位点基因型频率在胃癌组间分布对比差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,消化性溃疡组cagL D58、E59位点基因型分布差异有统计学意义(P<0.05);Logistic回归分析结果显示胃癌组中cagL D58 AG、GG与cagL E59 AG、AA均为胃癌发生的危险基因型;胃癌患者临床分析结果显示cagL D58、E59基因多态性位点各基因型与患者淋巴结转移、TNM分期及浸润深度显著相关(P<0.05)。结论幽门螺杆菌cagL氨基酸多态性与胃癌及消化性溃疡发病有关,而D58位点GG、AG基因型与E59位点AA、AG基因型可增加胃癌的发病风险。

幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原的可溶性表达及其多克隆抗体的制备和分析

目的:利用原核表达和蛋白质纯化技术获得高纯度的幽门螺杆菌致病岛CagL重组抗原(rCagL),利用其制备anti-CagL多克隆抗体,并分析抗体的特异性。方法:通过生物信息学软件分析rCagL的抗原结构;利用PCR长片段DNA合成技术合成不含有信号肽序列的幽门螺杆菌致病岛CagL基因,将其插入表达质粒p Czn1中,构建重组质粒pCzn1-rCagL。然后,将pCzn1-rCagL转入大肠杆菌Arctic Express中,经IPTG诱导表达后,通过Ni-IDA镍离子亲和层析纯化重组抗原rCagL,利用Western blot鉴定rCagL与His标签抗体和Anti-H.pylori抗体的免疫反应性;最后,通过rCagL辅以弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,制备anti-CagL多克隆抗血清,通过ELISA方法分析抗血清的特异性。结果:生物信息学软件表明重组抗原rCagL具有较好的抗原性质;重组质粒pCzn1-rCagL经双酶切和基因测序等技术鉴定,证实rCagL核苷酸序列与理论序列完全一致;基因工程菌株pCzn1-rCagL/Arctic Express在低温11℃条件经IPTG诱导表达。SDS-PAGE实验结果证实:rCagL可实现相对高效地可溶性蛋白表达,可溶性蛋白约占包涵体的62.07%。经Ni-IDA亲和层析柱纯化,可获得高纯度rCagL,纯度约为96.6%。Western blot结果证实:重组抗原rCagL可特异性与His标签抗体和Anti-H.pylori抗体结合。ELISA结果证实:经rCagL免疫小鼠制备的多克隆抗体anti-CagL可特异性识别rCagL和H.pylori裂解物,具有较高的抗体特异性。结论:重组抗原rCagL在低温条件下可实现可溶性表达,经纯化可获得高纯度抗原蛋白;rCagL具有较好的抗原性,制备的多克隆抗体具有较好的免疫特异性,为发展H.pylori相关诊断试剂奠定了实验基础。

一种改进的量子遗传算法研究

针对量子遗传算法容易早熟收敛和陷入局部最优的问题,提出了一种均衡收敛性和多样性的改进量子遗传算法(IQGA),可结合小生境技术,通过使用惩罚函数修正个体的适应度来淘汰相似性高的个体,使种群具有良好的多样性,避免局部最优,同时,在进化过程中采用动态调整量子旋转角θ的更新策略,加快算法的收敛速度。实验结果表明,IQGA算法可以有效避免传统量子遗传算法早熟收敛,具有寻优能力强、收敛快等优点,适合于一般连续函数优化问题。

重组幽门螺杆菌多价疫苗CTB-HUUL免疫治疗效果研究

目的构建口服重组幽门螺杆菌(H.pylori)多价疫苗CTB-HpaA-UreA-UreB-CagL(CTBHUUL),并探究其在BABL/c小鼠体内抗H.pylori SS1感染的免疫治疗效果。方法根据文献资料查找H.pylori相关黏附分子(HpaA、UreA、UreB)抗原的显性表位序列HpaA88-100、HpaA132-141、UreA27-53、UreA183-203、UreB229-251、UreB317-329、UreB321-339、UreB373-385、UreB438-452、UreB546-561,在其C端引入H.pylori黏附分子抗原CagL,再在其N端引入分子内黏膜佐剂CTB,通过Linker(EFM、GS、KK)将其串联,构建重组质粒pET28a(+)/CTB-HapA-UreA-UreB-CagL[pET28a(+)/CTB-HUUL]。将pET28a(+)/CTB-HUUL转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达后进行蛋白层析纯化,获得疫苗靶抗原CTB-HUUL,并采用Western Blot和ELISA对其进行免疫反应性和免疫原性鉴定。6周龄BABL/c小鼠,108 CFU,1次/d,进行灌胃,连续感染4次;末次灌胃后4周,灌胃CTB-HUUL重组蛋白200μg·次-1·周-1,连续免疫治疗4次。末次免疫治疗后2周,脱颈处死小鼠,取小鼠胃组织进行H.pylori SS1计数和病理切片HE染色。结果获得了高纯度的CTB-HUUL蛋白,Western Blot结果显示,CTB-HUUL可以与鼠抗H.pylori SS1血清及鼠抗CTB抗体发生特异性反应;ELISA检测结果显示,CTB-HUUL体外可以与重组蛋白rHpaA、rUreA、rUreB、rCagL发生特异性反应。CTB-HUUL组小鼠胃组织H.pylori SS1培养计数结果较CTB组和PBS组低(P<0.01),CTB-HUUL组小鼠胃组织炎症损伤程度及炎症细胞浸润程度较CTB组和PBS组轻微。结论口服重组H.pylori多价疫苗CTB-HUUL对感染H.pylori SS1的BABL/c小鼠具有免疫治疗效果。

幽门螺旋杆菌重组抗原表位肽C-CagAL构建及其多克隆抗体特异性分析

[目的]制备幽门螺旋杆菌重组抗原表位肽C-CagAL,并分析其多克隆抗血清的特异性。[方法]用分子克隆技术构建重组表达质粒pETC-CagAL,将其转入大肠杆菌中表达,利用Ni-Agarose亲和层析纯化目的蛋白C-CagAL;免疫BALB/c小鼠,制备抗C-CagAL多克隆抗血清,通过ELISA方法分析抗血清的特异性。[结果]DNAstar等软件表明C-CagAL具有较好的抗原性,Linker易形成转角或β-折叠,为柔性结构;重组抗原C-CagAL经大肠杆菌表达,约56kDa,占菌体总蛋白的19.82%,经Ni-Agarose亲和层析纯化,获得纯度为97.5%的重组抗原C-CagAL;抗C-CagAL多克隆抗血清能够特异性识别CagA和CagL。[结论]获得了一种能够激发抗CagA和CagL特异性抗体的重组抗原表位肽C-CagAL,为进一步研究其预防幽门螺旋杆菌感染的免疫效果奠定了基础。