脑神经环路常用技术及其在针灸领域应用研究

神经环路对大脑的信息传递与处理有着至关重要的作用。脑内神经环路异常是很多脑疾病临床表型的核心基础,探索神经环路对于预防与治愈脑疾病意义重大。如何能高效观测(即具有高时间、空间和细胞类型分辨率)神经环路是神经科学研究中一直探寻的方向。本研究就现阶段广泛应用的神经示踪技术、光遗传学、化学遗传学、钙成像-光纤记录及电生理技术等的应用研究进行探讨,对以上技术在针灸领域(吞咽障碍、消化和疼痛等)的应用进行述评,以期为神经环路相关研究提供新思路。

豚鼠心室肌细胞的分离及其基本电生理特性的观察

目的分离豚鼠单个心室肌细胞,并观察其基本电生理特性。方法Langendorff灌流,胶原酶法分离心室肌细胞;应用膜片钳全细胞模式记录心室肌细胞的动作电位和L型钙通道电流。结果酶法分离得到存活杆状细胞达50%以上。全细胞电流钳模式下记录,细胞静息电位为(-69.9±3.4)mV,复位到95%时的动作电位时程(APD95)为(313.1±38.9)ms。全细胞电压钳模式下记录到典型L型钙通道电流。结论该方法能够简单有效地获得性能稳定的心室肌细胞,尤其适用于膜片钳心电生理学的研究。

过氧化氢对大鼠心室肌细胞L-型钙通道电流的影响

目的:研究过氧化氢(H2O2)对单个大鼠心室肌细胞L-型钙通道电流(Ica,L)的影响。方法:用急性酶解法获得单个大鼠心室肌细胞;用标准的全细胞膜片钳技术记录钙通道电流,观察5mmol·L-1H2O2引起单个大鼠心室肌细胞Ica,L改变。结果:在5mmol·L-1H2O2作用下,大鼠心室肌细胞Ica,L峰值电流密度从4.89±0.52pA/pF增加至9.80±0.65pA/pF(P<0.05,n=10),电流-电压曲线下移,但激活电位、峰电位和翻转电位无明显改变;H2O2对Ica,L激活时间常数-电压曲线无明显影响,但可使其灭活时间常数-电压曲线明显向上移;H2O2对Ica,L稳态激活曲线无明显改变,但可使其稳态失活曲线明显左移,V0.5从(-26.85±5.3)mV左移至(-37.20±4.5)mV(P<0.05,n=5)。结论:H2O2可以增加大鼠心肌细胞Ica,L,且使其失活明显减慢。

某些环境和生产性粉尘颗粒对大鼠背根神经元HVA钙通道的影响

目的 分析呼吸系统感觉神经细胞、肺泡巨噬细胞在不同粉尘颗粒作用下HVA钙通道电流的变化,探讨它在粉尘性炎症中可能发挥的作用。方法 用呼吸性粉尘采样器采集焦炉逸散物、钢铁厂、城区大气和清洁区大气颗粒物,加上标准石英,共5种粉尘配成浓度为0、5、15、45、135μg/ml的悬液,对大鼠背根神经元（DRG）和肺泡巨噬细胞（AM）体外染尘;运用膜片钳技术记录全细胞高电压激活（HVA）钙通道电流。结果 石英组DRG HVA最大激活钙电流（Ica）增大,且随浓度增加而升高,当浓度达到135μg/ml时,Ica为-95.89±38.82 pA/pF,明显高于阴性对照组和低剂量组（P〈0.05）,存在一定的剂量反应关系（R^2=0.99）。焦炉逸散物5μg/ml组和钢铁厂粉尘颗粒135μg/ml组HVA钙电流最大激活斜率明显高于对照组（P〈0.05）;石英、城区和东湖大气颗粒物对HVA钙电流最大激活斜率的影响不明显。5种尘均能引起V1/2显著增大（P〈0.05）,向正值方向移动约4-6 mV。本研究未能记录到AM电压依赖性钙电流。结论 各粉尘颗粒导致DRG HVA钙通道的电流变化不一,它可能作为信号而引发不同的后续生物效应。

大鼠心室肌细胞单通道钙电流的记录及其电生理学特性分析

目的分离大鼠心室肌细胞,记录大鼠心室肌细胞的单通道钙电流,并分析其基本电生理学性质。方法胶原酶法分离大鼠心室肌细胞;应用膜片钳技术细胞贴附式和内膜向外式记录L-型钙通道的电流,并用pClamp10分析软件进行分析。结果分离得到大鼠心室肌细胞,细胞存活形态良好,呈杆状或柱状,具有清晰的横纹。记录到的L-型钙通道单通道电流,平均电流幅度为(1.13±0.01)pA,电导为19 pS,平均开放时间常数为(1.35±0.03)ms,平均关闭时间常数为(46.75±10.04)ms。此外,还记录到L-型钙通道的Run-down现象。结论本实验分离得到的大鼠心室肌细胞适用于膜片钳单通道记录模式;记录到的L-型钙通道的基本电生理学性质与文献报道相符。

左旋体盐酸非洛普的抗实验性心律失常作用

目的 研究左旋体盐酸非洛普 [levo 1 (2 ,6 二甲基苯氧基 ) 2 (3 ,4 二甲氧基苯乙氨基 )丙烷盐酸盐 ,l DDPH对实验性心律失常的抑制作用。方法 iv哇巴因、乌头碱或氯化钙制造大鼠、豚鼠室性心律失常模型 ;标准微电极技术记录动作电位 ;全细胞膜片钳技术记录L型钙电流 (ICa,L)。结果 l DDPH 5 0mg·kg-1抑制哇巴因诱发的豚鼠室性心律失常以及乌头碱和氯化钙诱发的大鼠室性心律失常 ;l DDPH 3 0 μmol·L-1缩短豚鼠右心室乳头肌细胞 5 0 %动作电位时程 (APD50 )并延长有效不应期 (ERP) (n =6,P <0 0 5 ) ;l DDPH抑制单个豚鼠心室肌细胞ICa,L,其IC50 值为 12 9(95 %可信限 :7 0～ 18 8) μmol·L-1(n =5 )。结论 l DDPH具有抗实验性心律失常作用 ;其机制与抑制ICa,L、缩短APD50

5-羟色胺对人胎盘滋养细胞钙通道的影响

目的探讨5-羟色胺对胎盘滋养细胞钙通道的影响。方法将体外培养的胎盘滋养细胞分成3组,低深度5-羟色胺组(5-TH,1μmol/L)、高浓度5-TH组(10μmol/L)和对照组。采用全细胞膜片钳方法,在胎盘滋养细胞外液中分别加入L-型钙通道阻滞剂、T-型钙通道阻滞剂、钠通道阻滞剂及5-TH,检测其电流值。结果在-60～-50mV电压时,胎盘滋养细胞L-型钙通道开放,-40～-30mV时,其最大峰值电流为(82.31±6.46)皮安(pA)。加入尼莫地平(Nimodpine)可阻断大部分电流。氟桂利嗪(Flunari-zne)和替曲朵辛(TTX)不能抑制该电流成分。加入1μmol/L和10μmol/L5-TH,其峰值电流分别为(104.77±10.84)pA和(117.16±9.67)pA,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);加入5-TH(1μmol/L)和Nimodpine、5-TH(10μmol/L)和Nimodpine后,峰值电流分别为(85.35±6.54)pA和(89.42±7.62)pA,与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论5-TH可激活胎盘滋养细胞L-型钙通道,促使钙电流值增加。

钙调蛋白激酶Ⅱ抑制剂对肥厚心肌细胞的影响

目的 观察钙调蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）抑制剂KN-93对肥厚心肌细胞L型钙电流（ICa,L）及细胞内钙离子浓度（[Ca2＋]i）的影响.方法 选取雌性新西兰大白兔48只,随机（随机数字法）分为4组：假手术组（sham组）、心肌肥厚组（LVH组）、心肌肥厚＋KN-93组（KN-93组）、心肌肥厚＋KN-92组（KN-92组）,每组12只,通过缩窄腹主动脉制备兔心肌肥厚模型,Sham组仅游离腹主动脉未进行缩窄.8周后,采用胶原酶消化法分离单个心肌细胞,应用穿孔膜片钳技术记录L型钙电流（ICa,L）；应用钙荧光指示剂Fura-2/AM结合图像分析技术测定各组心肌细胞内[Ca2＋]i.结果 8周后,心肌肥厚模型建立成功.在0 mV时LVH组、Sham组的峰值ICa.L分另为（1.38±0.3）nA、（0.87±0.1）nA（P＜0.01,n=12）,电流密度分别为（6.7±1.0）pA/pF、（6.3 ±0.7）pA/pF（P＞0.05,n=12）.当KN-92及KN-93在浓度为0.5μmol/L时,可分别使肥厚心肌细胞0 mV时的峰值ICa,L降低（9.4±2.8）％、（10.5±3）％（P＞0.05,n=12）；当浓度增至1 μmol/L时,其峰值ICa,L降低程度分别为（13.4±3.7）％、（40±4.9）％（P＜0.01,n=12）.Sham组、LVH组、KN-92组及KN-93组中心肌细胞[Ca2＋]i分别为（98.0±12.3）nmol/L、（154.0±26.2）nmol/L、（147.0±29.6）nmol/L和（108.0±21.2）nmol/L.结论 CaMKⅡ特异性抑制剂KN-93可有效抑制肥厚心肌细胞ICa.L,减轻细胞内钙超载,这可能是其抗肥厚心肌室性心律失常发生的主要细胞电生理机制.

5-羟色胺对人胎盘滋养细胞L-型钙通道的影响

目的探讨5-羟色胺对胎盘滋养细胞钙通道的影响。方法将体外培养的胎盘滋养细胞分为对照组和低(1.0μmol/L)、高(10.0μmol/L)浓度5-羟色胺组。采用全细胞膜片钳实验方法,在待测胎盘滋养细胞外液中分别加入Nimodpine(10μmol/L)、Flunarizne(10μmol/L)和替曲朵辛(TTX10μmol/L),进行电流检测;同样的实验条件和方法,在待测胎盘滋养细胞外液中分别加入5-TH(1μmol/L和10μmol/L),测试电流值;在细胞外液中分别加入5-TH(1μmol/L)和Nimodpine(10μmol/L)、5-TH(10μmol/L)和Nimodpine(10μmol/L)后再检测电流。结果胎盘滋养细胞L-型钙通道开放在-60～-50mV之间,最大峰值电流在-40～-30mV为82.31±6.46(pA)。加入Nimodpine(10μmol/L),可阻断此电流大部分成份。Flunarizne(10μmol/L)和TTX(10μmol/L)不能抑制该电流成份。加入5-TH(1μmol/L和10μmol/L)峰值电流明分别为104.77±10.84(pA)和117.16±9.67(pA),与对照组相比有显著差异(P<0.05);加入5-TH(1μmol/L)和Nimodpine(10μmol/L)、5-TH(10μmol/L)和Nimodpine(10μmol/L)后,峰值电流分别为85.35±6.54(pA)、89.42±7.62(pA),与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结论5-TH可激动胎盘滋养细胞L-型钙通道,促使钙电流值增加。