基于UPLC-Q-Exactive MS和GC-MS代谢组学技术分析牛大力花不同生长时期的化学成分差异性

目的以不同生长时期的牛大力花为研究对象,基于代谢组学技术,系统分析其代谢物的组成和积累差异,为其开发利用提供方向。方法采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Exactive MS)和气相色谱-质谱(GC-MS)技术,对牛大力花的次生代谢物、初生代谢物和挥发性物质进行全面分析,使用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)和层次聚类分析(HCA)等代谢组学方法筛选差异性成分。结果液质联用共鉴定了332个代谢物,以黄酮类、三萜类和苯丙素类等次生代谢物为主。气质联用共鉴定了297个代谢物,以有机酸类、氨基酸类、糖类、杂环类、醇类等初生代谢物和挥发性物质为主。主成分分析结果表明,液质与气质的代谢组学结果一致,4个生长时期牛大力花样本的总体分布聚集为2类:花蕾期、初花期、盛开期归为1类,凋萎期单独归为1类,两者化学物质组成存在显著差异,分别以黄酮类和原花青素、三萜类、有机酸类为差异成分。蔓性较直立性牛大力花在花蕾期、初花期、盛开期含有特征性的黄酮类差异代谢物,部分黄酮类成分随花期的发展含量逐渐降低。结论研究结果表明,牛大力花中含有丰富的活性黄酮类代谢物,以蔓性牛大力初花期的产量和黄酮含量更高,具有开发价值。本研究为牛大力花的科学开发和合理利用提供了理论依据。

茉莉酸甲酯调控牛大力有效成分积累及相关基因表达

目的:研究外源茉莉酸甲酯(methyl Jasmonate,MeJA)对牛大力有效成分含量的影响,探究其对异黄酮生物合成以及茉莉酸(jasmonate,JA)信号通路关键酶基因的调控模式。方法:以牛大力幼苗为材料,采用HPLC法分析MeJA对有效成分含量的影响,利用Illumina HiSeq平台进行转录组测序,并利用qRT-PCR技术验证相关基因的表达量。结果:外源MeJA诱导提高了牛大力有效成分芒柄花素与高丽槐素的含量。基于牛大力参考基因组数据库,鉴定出20727个差异基因(DEGs),其中9091个为上调基因,主要富集在植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、异黄酮生物合成等代谢通路,qRT-PCR结果验证了转录组测序结果准确可靠。外源MeJA激活了部分异黄酮生物合成和JA信号通路关键酶基因的表达,其中异黄酮生物合成途径基因CHS、HIDs、I3′Hs、VR、PTR、CYP81E7、7IOMT、PTS等呈上调表达;JA信号通路基因LOXs、AOSs、OPR、ACXs、JAZs和MYCs等呈上调表达。结论:牛大力在响应外源MeJA诱导的过程中可激活CHS、HID-1、VR等异黄酮生物合成途径和LOX、MYC等JA信号通路关键酶基因,从而正向调控其有效成分芒柄花素与高丽槐素含量。

牛大力总RNA提取的CTAB法改进及优化

采用改良CTAB法提取牛大力总RNA,采用琼脂糖凝胶电泳、核酸蛋白分析仪和RT-PCR检测所提取总RNA样品的质量。结果表明,改良CTAB法提取的牛大力不同组织或器官的RNA纯度和完整性良好,可满足RT-PCR反应等后续试验的要求。

美丽鸡血藤种质资源遗传多样性的ISSR分析

采用ISSR分子标记技术对来自广东、广西及海南3省的19个居群57份美丽鸡血藤种质及其易混淆的3份近似种种质的遗传多样性和亲缘关系进行研究,旨在为美丽鸡血藤种质资源的鉴定、保护和开发利用提供参考.结果表明：8条ISSR引物在美丽鸡血藤基因组中扩增条带共91条,其中多样性条带76条,占84.4％;Nei,s基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（Ⅰ）分别为0.258 3和0.396 0,这表明美丽鸡血藤种质的多样性丰富;群体遗传分化系数（Gst）和基因流（Nm）分别为0.651 5和0.267 5,这表明居群间遗传分化明显,基因流水平偏低：聚类分析结果显示所有美丽鸡血藤种质主要分为2大类,亲缘关系与地理分布并不具有明显的一致性.4个近似种间的遗传距离为0.235 2～0.416 2,其中以广东鸡血藤与美丽鸡血藤的亲缘关系最近,筛选出的4条ISSR引物能对这4个物种进行有效区分,可用于物种的鉴别分析.

牛大力马尾松林下种植技术规范

以《中药材生产质量管理规范》(中药材GAP)为指导原则,对牛大力马尾松林下种植技术的栽培物种、产地环境、栽培管理、采收与初加工、质量要求和档案记录进行了规定,为提高牛大力质量和产量提供技术保障。

不同栽培基质对牛大力根系发育的影响

以不同比例泥土、砂、椰糠、草炭混合作为牛大力栽培基质,并进行盆栽试验,研究不同栽培基质条件下,基质的养分特征及其对牛大力根系生长和膨大状况的影响。结果表明:由草炭+泥土(体积比2∶1)及草炭+椰糠+砂(体积比1∶2∶1)混合的基质p H值较适中,有机质含量与氮磷钾养分含量均较高,养分状况较理想,牛大力根系发达,但膨大块根较少;而泥土与砂混合基质各项指标均比较低,养分比较贫乏,牛大力根系发达,但块根膨大明显。在本研究条件下,基质养分不是根系膨大的关键因素,泥土含量高的基质可能因为较为理想的通气和热量条件而有利于块根的膨大。

牛大力种子萌发过程中的生理生化变化

本文在于研究种子萌发过程中生理生化变化规律,为牛大力(Callerya speciosa)种苗培育提供理论支撑。对牛大力种子萌发时期可溶性糖、抗氧化酶活性、游离氨基酸、蛋白酶、总酚含量进行测定,研究牛大力种子萌发不同时期的各项生理生化指标的动态变化,并比较他们之间的相关性。在牛大力种子萌发过程中,22d时可溶性糖含量达到最高值,为0.430 mg·g-1,随后持续降低。超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性在22d达到最高值,分别为300.28,810U·g-1 FW,过氧化物酶(POD)活性在萌发过程第17d达到最高值,为240U·g-1 FW,这3种抗氧化酶活性均呈现先升高后下降的趋势;游离氨基酸呈先升后降再陡然上升的趋势;蛋白酶活性在第22d时达到最大值,为1.101mg·g-1·h-1,呈先升后降的趋势;总酚含量在0d时最高,为77.81μg·g-1,随后出现无规律性变化,但总体呈降低趋势。相关性分析表明,牛大力种子萌发过程中,物质和能量代谢与POD、CAT及蛋白酶等的作用有很大关系;POD、CAT在种子萌发过程中不仅能消除植物体内产生的过氧化氢等有害物质,也可能在一定程度上参与了种子的其他代谢活动;总酚在种子萌发过程中通过抑制SOD酶活性影响牛大力种子的萌发。

牛大力腋芽小滴玻璃化法超低温保存后遗传稳定性分析

使用ISSR和SSR两种分子标记检测小滴玻璃化法超低温保存牛大力(Callerya speciosa)腋芽后再生植株的遗传稳定性。从100条ISSR引物中筛选出17条适合引物,共扩增出128条DNA条带。从53条牛大力SSR引物中选出8条引物进行银染检测。结果显示,ISSR和SSR分子标记,对照和超低温保存后再生植物无差异性条带。两种分子标记的结合充分证明了牛大力在超低温保存后其基因组DNA序列均无变异,因此该材料的遗传稳定性没有受到影响。

南药牛大力组培苗生产技术规程

遵照《中药材生产质量管理规范》(GAP)的宗旨,规范南药牛大力组培苗生产的物种选择、组织培养、瓶内炼苗、瓶外炼苗、出圃、装框、运输和档案记录,旨在提高南药牛大力组培苗的质量。

牛大力主要病虫害调查及白粉病的防治技术研究

通过田间调查,梳理牛大力病虫害种类及流行规律。采取随机区组设计,比较不同药剂对牛大力的防治效果,探索最佳的绿色防控技术。结果表明,牛大力病虫害发生较少,但其在幼苗时期容易感染病害及虫害,主要包括了根腐病、锈病、白粉病、炭疽病、霜霉病、叶枯病、根结线虫病及蚜虫等;5种药剂对牛大力白粉病的防治均有效果,其中,25%三唑酮的防治效果为98.0%,42%寡糖·硫磺的为89.0%,1%蛇床子素的为76.8%,0.5%大黄素甲醚的为27.6%,哈茨木霉菌的为13.8%。25%三唑酮、42%寡糖·硫磺、1%蛇床子素3种药剂的防治效果最好,且三者间无显著差异;牛大力白粉病的最佳绿色防治技术为42%寡糖·硫磺与1%蛇床子素交错使用。

牛大力块根糖积累及其相关酶活性变化研究

为提高牛大力块根的产量与品质,该研究以不同发育时期(移栽6、12、18、24、30、36个月)的牛大力块根为材料,采用紫外分光光度法对糖类含量及其相关酶活性进行测定,研究它们在牛大力块根发育过程中的动态变化规律。结果表明:(1)牛大力块根的生长发育进程可初步划分为形成期(移栽6~12个月)、迅速膨大期(移栽12~24个月)与稳定膨大期(移栽24~36个月)三个阶段。淀粉与蔗糖分别是牛大力块根中主要的多糖与可溶性糖。在牛大力块根发育过程中,多糖类物质的含量逐渐增加,而可溶性糖含量逐渐减少,两者之间呈显著负相关,推测可溶性糖的分解代谢有利于促进多糖类物质的积累。(2)蔗糖的分解代谢是蔗糖合酶(SUS)、蔗糖磷酸合酶(SPS)、酸性转化酶(AI)与中性转化酶(NI)等多种相关酶协同作用的结果。SUS在牛大力块根发育过程中发挥着既催化蔗糖合成,又催化蔗糖分解的双重调节作用,SUS(合成)的活性不断上升,至移栽36个月达到峰值,极显著高于其他时期;SUS(分解)的活性从移栽6个月至24个月逐渐上升,但在块根稳定膨大期稍有下降;其净活性为催化蔗糖分解,在移栽12个月达到最高。转化酶AI和NI的活性均在块根发育过程中逐渐上升,且AI活性高于NI活性,提示AI可能在蔗糖代谢分解过程中发挥更重要的作用。该研究结果可为今后深入研究牛大力多糖类成分积累和调控机制提供理论依据,并为提高牛大力药材的产量与品质提供技术指导。

牛大力metacaspase基因CsMC1的克隆及超表达载体构建

精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸酶(metacaspases, MCs)在植物生长发育的细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)过程中发挥着十分重要的调控作用。已有研究表明metacaspase蛋白酶能参与木质部PCD过程,促进管状分子成熟与加快木质化进程。为了研究牛大力metacaspase蛋白酶编码基因的结构特征与功能,本研究基于前期构建的转录组数据库,采用RT-PCR技术成功克隆了一个metacaspase基因,命名为CsMC1(登录号:MW888914)。该基因全长1 245 bp,包括一个1 098 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码365个氨基酸。通过序列比对与系统进化树分析,发现CsMC1蛋白的氨基酸序列具有典型的N端前结构域与LSD1锌指结构,推测属于Ⅰ型metacaspase蛋白酶;其氨基酸序列与蔓花生AdMC1的高度一致,两者位于同一进化分支,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,牛大力Cs MC1基因在不同组织与不同类型根中均有表达,以不膨大根的表达量最高;随着块根的发育进程,Cs MC1的表达量逐渐升高,推测CsMC1基因可能正向调控次生木质部PCD过程中的木质化进程。同时,利用Gateway技术成功构建了PK2GW-CsMC1植物超表达载体。研究结果为进一步阐明牛大力Cs MC1基因的功能和解析牛大力块根膨大受阻的分子机制提供了技术依据。

牛大力蔗糖合酶基因CsSuSy克隆与表达特征分析

蔗糖合酶(sucrose synthase,SuSy)是催化蔗糖代谢的关键酶之一,参与蔗糖的分解、淀粉的生物合成等代谢过程,在植物的生长发育中发挥着至关重要的调控作用。本研究从牛大力转录组数据库筛选并克隆得到两个蔗糖合酶基因CsSuSy1与CsSuSy2,CsSuSy1全长2326 bp,包括2307 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码768个氨基酸;CsSuSy2基因全长3028 bp,包括2439 bp的ORF,编码812个氨基酸。CsSuSy1与CsSuSy2的蛋白结构预测分子量分别为87.8 kD与92.6 kD,理论等电点分别为5.91与5.75,二级结构主要为α-螺旋与无规则卷曲。保守结构域分析结果显示它们属于PLN00142超级家族成员,包含蔗糖合酶结构域(Sucrose_synth)与糖基转移酶结构域(Glycos_transf_1)两个保守结构域,与同科其它近缘种的SuSys氨基酸序列具有较高的相似性。系统进化树分析显示主要分为两个大分支。qRT-PCR检测结果显示CsSuSy1和CsSuSy2分别在块根膨大初期、块根膨大初期和中期高表达,且表达量显著高于茎、叶和成熟种子。鉴于在牛大力块根发育过程中CsSuSys1基因表达量与多糖含量呈极显著负相关、与淀粉含量呈显著负相关,CsSuSys2基因表达量与多糖含量呈显著负相关,推测CsSuSys1和CsSuSys2在块根膨大前期或中期协同参与催化蔗糖降解,促进块根中多糖和淀粉的积累。本研究结果为揭示蔗糖合酶参与牛大力块根膨大过程的蔗糖代谢提供证据,有助于进一步阐明牛大力块根膨大的分子机制。

牛大力漆酶基因CsLAC17的克隆与载体构建

为研究漆酶在牛大力生长发育过程中的生物学功能,本实验以牛大力叶片为材料,从反转录PCR获得的cDNA中扩增出漆酶基因CsLAC17全长。序列分析表明,CsLAC17 c DNA全长为2 010 bp,开放阅读框大小为1 755 bp,编码一个由584个氨基酸组成的蛋白质。结构域分析表明,Cs LAC17蛋白的保守结构域具有漆酶典型结构域的特征——铜离子结合域(Cu-oxidase和Cu-oxidase-2)。同源序列分析表明,Cs LAC17蛋白序列与绿豆(Vigna radiata var. radiata)和野生大豆(Glycine soja)同源性为88%、藜豆(Mucuna pruriens)87%、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) 85%。组织特异性表达分析显示,CsLAC17在茎中表达量最高,叶中表达量次之,根中较少。此外,进一步构建了pBI121-CsLAC17过表达载体并转入农杆菌。本研究为日后CsLAC17基因的功能验证以及为牛大力开展分子生物学研究提供帮助。

氮素种类对牛大力根系生长及植株生理特性的影响

目的 探究不同的氮素种类对牛大力生长及其产量性状的影响,为牛大力大田栽培中的肥料合理使用提供理论指导。方法 以“广泽一号”牛大力为研究对象,采用温室盆栽方式,进行不同的氮素处理:磷酸一铵(T_(1))、硫酸铵(T_(2))、硝酸钙(T_(3))、尿素(T_(4)),以施用清水为对照(T_(0)),对其农艺性状、光合参数、生理指标、根系生长指标进行观察和检测。结果 硫酸铵能显著增强牛大力叶片净光合速率,促进其侧根的形成及膨大,其处理的根鲜重、膨大根鲜重及干重、膨大根条数、根长、地上鲜重皆为最大,较对照分别显著增加了31.79%、24.48%、29.51%、71.18%、6.93%、27.29%。硫酸铵、硝酸钙均显著提高牛大力叶片可溶性糖、可溶性蛋白含量,增强其硝酸还原酶(NR)与谷氨酰胺合成酶(GS)活性,硝酸钙的根系生长指标均与对照无显著差异。结论 硫酸铵对牛大力的生长及根系膨大具有良好的促进作用。