湖羊钙蛋白酶3基因多态性与生长性状关联分析

为了探究湖羊钙蛋白酶3(CAPN3)基因多态性与生长性状的关联性,采用PCR产物直接测序技术筛选湖羊CAPN3基因单核苷酸多态性(SNPs)位点,进行遗传学分析,并将SNPs与湖羊的生长性状进行关联分析。结果显示:在湖羊CAPN3基因中检测到11个SNPs,其中3个为低度多态,8个为中度多态,有3个SNPs与湖羊的生长性状显著相关,其中g.42772T>G与湖羊断奶到6月龄(180日龄)日增重和6月龄(181日龄)到周岁日增重显著相关,TT基因型的断奶到6月龄日增重显著高于GG基因型(P<0.05),TT、TG基因型的6月龄到周岁日增重显著高于GG基因型(P<0.05);g.42875C>T与湖羊初生重、断奶到6月龄日增重、6月龄到周岁日增重显著相关,CC基因型的初生重显著高于CT基因型(P<0.05),CC基因型的断奶到6月龄日增重显著高于TT基因型(P<0.05),CC与CT基因型的6月龄到周岁日增重显著高于TT基因型(P<0.05);g.55993T>C与湖羊胸围显著相关,CC基因型的胸围显著高于TT基因型(P<0.05)。提示:这3个SNPs与湖羊的生长性状显著相关,可能是湖羊生长性状的重要分子标记。

钙蛋白酶(Calpain)抑制剂药理活性的研究进展

钙离子(Ca^(2+))作为细胞的第二信使,是参与人体内各项活动的重要调控因子,钙蛋白酶(Calpain),它是一种中性半胱氨酸蛋白酶,主要受Ca^(2+)激活,Calpain在许多生理过程中发挥了很大的作用,例如细胞周期的调控与凋亡,还有细胞信号转导和葡萄糖转运等.近年来,人们对这类酶的兴趣大大增加,因为它与脑缺血和其他神经损伤、神经退行性疾病如阿尔茨海默病、心肌缺血相关的神经细胞死亡有很大关系,因此本文对钙蛋白酶抑制剂在神经细胞损伤、失血性休克、缺血再灌注以及阿尔茨海默病研究等方面进行了综述.

曲美他嗪对心肌缺血再灌注损伤大鼠钙蛋白酶的调控及其对细胞凋亡的作用机制

目的:探讨美他嗪对心肌缺血再灌注损伤大鼠钙蛋白酶(Calpain)的调控及其对细胞凋亡的作用机制。方法:采用随机数字表法将30只SD大鼠分为假手术组(Sham组)、模型组和曲美他嗪干预组,每组10只。Sham组大鼠仅置缝线但不结扎冠状动脉,其余两组大鼠均采用手术结扎大鼠心肌冠状动脉左前降支(LAD)进行造模,造模期间,Sham组和模型组大鼠给予0.9%氯化钠溶液灌胃处理,曲美他嗪干预组大鼠给予曲美他嗪20 mg/kg灌胃处理。采用苏木精-伊红染色法观察各组大鼠心肌组织情况,以速率法对肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)等心肌酶指标水平进行测定;采用DNA原位末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡情况,并应用免疫组织化学法检测心肌组织中Caspase-3、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白表达水平;通过荧光分光光度计测定荧光强度来体现Calpain活性,并采用蛋白质印迹法测定焦亡相关蛋白表达水平[核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、Caspase-1 P10蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和白细胞介素1β(IL-1β)]。结果:Sham组大鼠心肌细胞核清晰可辨,心肌纤维整齐排列,胞浆均匀着色;模型组大鼠心肌细胞核浓缩,心肌纤维排列混乱,细胞变性呈空泡状,且可伴有炎症细胞浸润;曲美他嗪干预组大鼠心肌细胞间质呈轻度水肿,心肌纤维排列无异常。Sham组大鼠未发生心肌梗死;曲美他嗪干预组大鼠心肌梗死面积较模型组显著缩小(P<0.05);模型组和曲美他嗪干预组大鼠心肌酶CK、LDH水平均明显高于Sham组,其中曲美他嗪干预组各项心肌酶指标水平均低于模型组(P<0.05),差异均有统计学意义。Sham组中可见少量心肌细胞凋亡,模型组中心肌细胞呈弥漫分布,凋亡数量明显增多;经曲美他嗪干预后,心肌细胞凋亡明显减少。与Sham组相比,模型组大鼠Caspase-3蛋白表达水平明显升高,Bal-2蛋白水平明显降低(P<0.05);与模型组相比,曲美他嗪干预组大鼠Caspase-3蛋白表达水平明显降低,Bal-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05),差异均有统计学意义。模型组大鼠缺血/再灌注(I/R)心肌细胞Calpain活性明显高于Sham组和曲美他嗪干预组,差异有统计学意义(P<0.05),Sham组与曲美他嗪干预组大鼠I/R心肌细胞Calpain活性的差异无统计学意义(P>0.05)。模型组和曲美他嗪干预组大鼠NLRP3、IL-1β、ASC和Caspase-1 P10蛋白表达水平均明显高于Sham组,曲美他嗪干预组各项焦亡蛋白相关水平均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:曲美他嗪可通过抑制Calpain活性来减轻细胞凋亡,进而起到减轻心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏损伤的作用。

鲢鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的结构建模、内源抑制剂对接及其钙结合机制

【目的】分析鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(Myofibril-bound serine proteinase,MBSP)结构的基础特性。【方法】使用AlphaFold2对鲢MBSP进行结构建模,通过保守性分析、静电势计算、分子对接等手段探讨鲢鱼MBSP的结构特征,并借助分子动力学模拟研究钙结合对其结构的影响。【结果与结论】鲢鱼MBSP的活性酶形式含222个残基,有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的典型结构特征,但表面充斥着更多赖氨酸,使其表面“粗糙”且利于离子键形成。62Asn及61Glu是其关键的钙结合位点,钙结合导致的结构变动可传至C端,40His、自溶环、氧阴离子稳定环等关键区域的柔性变化是钙激活机制中的重要部分。葡萄糖-6-磷酸异构酶二聚体上的10Arg及17Lys是参与鲢鱼MBSP底物结合竞争的潜在关键位点。除催化活性口袋外,潜在的变构位点亦是MBSP抑制剂设计的可选出发点。

巨噬细胞钙蛋白酶促进动脉粥样硬化进展

动脉粥样硬化(As)是一种脂质驱动的慢性炎症性血管疾病,其发病机制以脂质代谢紊乱和炎症反应为主。钙蛋白酶(calpain)是钙离子依赖性半胱氨酸蛋白酶,研究显示其参与了As的发生发展,特别是存在于巨噬细胞中的Calpain对细胞的脂质代谢和炎症反应均有着重要调节作用。文章就巨噬细胞中Calpain参与As的可能途径及分子机制进行综述,为As的防治提供新的思路。

针刀对肌性斜颈模型兔胸锁乳突肌中calpain-1、CD45、MMP-2、TIMP-2蛋白表达的影响

目的:应用肌性斜颈兔动物模型,探讨针刀治疗肌性斜颈的作用机制及意义。方法:无水酒精注射制备动物肌性斜颈兔子模型后,选取模型兔子48只,随机分为正常组、模型组、针刀组、按摩组,每组12只。分别给予各组对应治疗,治疗2个月后各组分别取部分胸锁乳突肌制作标本,免疫组化法观察钙蛋白酶1(calpain-1)、分化抗原决定簇45(CD45)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶抑制因子2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2,TIMP-2)在各组肌纤维中的表达情况。结果:与正常组比较,其余各组实验动物明显出现颈部活动受限、斜颈、头颈不对称症状,而治疗结束后,针刀组和按摩组实验动物颈部活动受限改善,无明显头颈不对称症状。calpain-1、CD45、TIMP-2的表达,与正常组比较,模型组、按摩组上调(P<0.01);与模型组比较,针刀组、按摩组下调(P<0.01);与针刀组比较,按摩组上调(P<0.01)。MMP-2表达,与正常组比较,模型组下调(P<0.01),与模型组比较,针刀组、按摩组上调(P<0.05)。结论:针刀治疗肌性斜颈效果显著,其作用机制可能与减少calpain-1、CD45、TIMP-2表达,增加MMP-2表达有关。

siRNA沉默钙蛋白酶1对人脑胶质瘤细胞LN229增殖及侵袭的影响

目的 探讨siRNA沉默钙蛋白酶1(CAPN1)对人脑胶质瘤细胞LN229增殖及侵袭的影响。方法 取人脑胶质瘤细胞LN229于37℃水浴中解冻后制备单细胞悬液,接种于细胞培养板中,融合度至90%左右,将siRNA系列、CAPN1 siRNA序列分别转染细胞,分为实验组(CAPN1 siRNA)与siRNA组,以未转染的细胞作为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定LN229细胞中CAPN1 mRNA表达;采用MTT法测定LN229细胞增殖情况;采用Transwell小室测定LN229细胞侵袭及迁移情况;采用Western blot测定LN229细胞Bax、Bcl-2和CAPN1蛋白表达。结果 与对照组和siRNA组比较,实验组CAPN1 mRNA表达明显降低(P<0.05);与对照组和siRNA组比较,实验组LN229细胞增殖率明显降低(P<0.05);与对照组和siRNA组比较,实验组LN229细胞侵袭率明显降低(P<0.05);与对照组和siRNA组比较,实验组LN229细胞迁移数目明显降低(P<0.05);与对照组和siRNA组比较,实验组LN229细胞Bax蛋白表达灰度值明显升高,而Bcl-2和CAPN1蛋白表达灰度值明显降低(P<0.05)。而对照组和siRNA组CAPN1 mRNA表达、LN229细胞增殖率、LN229细胞侵袭率、LN229细胞迁移数目、Bax、Bcl-2和CAPN1蛋白表达灰度值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 siRNA沉默CAPN1可抑制人脑胶质瘤细胞LN229增殖,抑制脑胶质瘤细胞侵袭和迁移,上调Bax表达及下调Bcl-2和CAPN1蛋白表达。

牛腰肌中μ-钙蛋白酶基因表达量和蛋白活性与嫩度的关系

牛肉嫩度是影响牛肉品质的重要因素,μ-钙蛋白酶是影响牛肉嫩度的关键酶。本研究的目的是探究夏南母牛,夏南公牛,西门塔尔公牛肉中μ-钙蛋白酶mRNA表达量和蛋白活性与嫩度的关系。本研究选取年龄为48月龄的夏南母牛3头,18月龄的夏南公牛3头,15月龄的西门塔尔公牛3头,以腰最长肌为研究对象。利用实时荧光定量PCR分析不同品种牛腰最长肌中μ-钙蛋白酶mRNA表达量;采用酪蛋白酶谱法分析成熟3 d时不同样品μ-钙蛋白酶活性的差异;通过剪切力测定不同品种牛腰最长肌肉质嫩度的差异。结果发现:3个样品牛肉中μ-钙蛋白酶基因mRNA表达量差异不显著(P>0.05);夏南牛与西门塔尔牛肉中μ-钙蛋白酶活性差异极显著(P<0.01);夏南牛与西门塔尔牛剪切力差异极显著(P<0.01)。结论:3个样品腰最长肌中μ-钙蛋白酶的mRNA表达量与牛肉嫩度无显著相关性,夏南母牛比夏南公牛嫩度好,夏南公牛比西门塔尔公牛嫩度好。

钙蛋白酶2通过诱导三阴乳腺癌细胞上皮间质转化抵抗紫杉醇的机制探讨

目的观察钙蛋白酶2(Calpain-2)在三阴乳腺癌细胞抵抗紫杉醇(PTX)中的作用及机制。方法人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞转染Calpain-2质粒及相应空载体,设为过表达组和空载体组,同时以未转染细胞作为空白组。MTT法检测PTX对各组细胞存活率的影响;免疫荧光实验检测YAP的分布情况;蛋白质免疫印迹实验检测Calpain-2、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、磷酸化大肿瘤抑制基因1(pLATS1)及磷酸化yes相关蛋白(p-YAP)表达。在过表达Calpain-2的基础上加用YAP抑制剂XMU-MP-1进行干预,观察YAP对PTX抵抗的介导作用。结果与空载体组相比,PTX处理后过表达组细胞存活率增加,半数抑制浓度(IC50)升高(P<0.05)。与空载体组相比,过表达组细胞N-cadherin和Vimentin蛋白表达上调,E-cadherin蛋白表达下调(P<0.05),p-LATS1和p-YAP蛋白表达上调(P<0.01),YAP在细胞核内分布减少。与过表达组相比,XMU-MP-1+过表达组N-cadherin和Vimentin蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达上调(P<0.01)。PTX处理后,与过表达组相比,XMU-MP-1+过表达组细胞存活率减少,IC50降低(P<0.01)。结论Calpain-2通过YAP诱导三阴乳腺癌细胞上皮间质转化,从而对PTX产生药物抵抗。

钙蛋白酶在TOCP诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬中的调节作用

目的探究钙蛋白酶对三邻甲苯基磷酸酯(TOCP)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬的调节作用。方法不同浓度TOCP处理未分化和分化的SH-SY5Y细胞,用荧光分光光度法检测钙蛋白酶活性。抑制钙蛋白酶活性后,通过Western blotting检测TOCP对自噬相关蛋白的影响;抑制钙通道后,用荧光分光光度法检测胞质钙离子浓度对钙蛋白酶活性的影响。结果TOCP诱导未分化和分化的SH-SY5Y细胞钙蛋白酶活性上升;钙蛋白酶抑制剂可降低TOCP诱导的自噬相关蛋白LC3-II和Beclin1表达。维拉帕米和2-APB阻断钙通道后钙蛋白酶活性降低,维拉帕米而非2-APB可以抑制TOCP诱导的自噬相关蛋白LC3-II表达。结论TOCP在未分化和分化的SH-SY5Y细胞中诱导的自噬受钙蛋白酶活性的调节。

日粮不同蛋白质水平对猪骨骼肌钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶基因表达及嫩度的影响

为研究饲料不同蛋白质含量对calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量,选用54头约50kgLY(长×大)二元杂交去势公猪,随机分为3个处理,每个处理3个重复,每个重复3头猪,分别饲喂蛋白质水平为10%、18%和26%的日粮,各日粮能量及氨基酸模式保持一致,饲养76d后屠宰取样,用荧光相对定量PCR测定猪背最长肌中calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量,及其对剪切力的影响。结果表明,日粮不同蛋白质水平对calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量有显著影响(P<0.01)。calpastatin mRNA在骨骼肌中的表达量随日粮蛋白质水平的升高而升高。μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量随日粮蛋白质水平的升高而下降。骨骼肌剪切力与calpastatin表达量显著正相关,骨骼肌中calpastatin mRNA的表达量越高,骨骼肌剪切力值越高(P<0.01),相关系数为0.859。骨骼肌剪切力与μ-calpain显著负相关,骨骼肌中μ-calpain mRNA的表达量越高,骨骼肌剪切力值越低(P<0.05),相关系数为-0.748。骨骼肌中calpastatin mRNA的表达量与μ-calpain mRNA的表达量显著负相关,calpastatin mRNA表达量越高,μ-calpain mRNA的表达量越低(P<0.01),相关系数为-0.875。即日粮不同蛋白质水平对calpastatin和μ-calpain mRNA在骨骼肌中的表达量有显著影响。

不同饲喂方式对猪背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白和钙蛋白酶基因表达及剪切力的影响

为研究不同饲喂方式对猪背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)和μ-钙蛋白酶(μ-calpain)mRNA丰度,以及对肌肉剪切力的影响,54头约60kg的杜×长×大三元杂交去势公猪被随机分为3个组,每组3个重复,每个重复6头猪。第1组为对照组,自由采食;第2组为补偿生长组,前20d限饲30%,后20d自由采食;第3组为限饲组,全期限饲30%。所有猪饲养40d后屠宰取样,用实时定量PCR测定猪背最长肌中calpastatin和μ-calpain mRNA相对丰度。结果表明,背最长肌calpastatin和μ-calpain mRNA相对丰度在自由采食组和补偿生长组间差异不显著(P>0.05);在补偿生长组和限饲组间差异显著(P<0.05);在自由采食组和限饲组间差异极显著(P<0.01)。背最长肌剪切力与calpastatin表达量显著正相关,相关系数为0.5059。背最长肌剪切力与μ-calpain相对丰度显著负相关,相关系数为-0.4757。背最长肌中calpastatin mRNA相对丰度与μ-calpai nmRNA相对丰度负相关,相关系数为-0.0559。结果表明补偿生长和限饲均可以增强calpastatin和μ-calpain基因在转录水平的调控。

钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素在老年聋大鼠耳蜗中的表达

目的确定钙蛋白酶在老年聋大鼠耳蜗中的表达和钙蛋白酶-钙蛋白酶抑素平衡变化与老年耳聋的相关性。方法采用免疫组织化学染色确定钙蛋白酶在老年大鼠耳蜗中的表达水平和组织定位,采用即时PCR技术分析耳蜗提取物中钙蛋白酶和钙蛋白酶抑素mRNA水平的变化。结果钙蛋白酶主要分布在耳蜗组织的内外毛细胞、神经元细胞和血管纹。在青年组大鼠耳蜗组织中钙蛋白酶有低水平表达,在老年大鼠耳蜗中的表达明显高于青年组。不同程度耳聋的耳蜗毛细胞、神经元和血管纹的钙蛋白酶表达趋势相似。但钙蛋白酶在血管纹中表达低于神经元和毛细胞。在老年耳聋组,耳蜗提取物中的钙蛋白酶mRNA水平比青年组增高5.7倍(P<0.01),而钙蛋白酶抑素的mRNA水平减低了3倍(P<0.01)。结论钙蛋白酶-钙蛋白酶抑素系统平衡紊乱在老年耳蜗组织退化和听力障碍发生过程中有重要作用。

葛根素对大鼠局部脑缺血再灌注损伤皮层钙凋磷酸酶和钙蛋白酶活性的影响

目的 探讨葛根素在局灶性脑缺血 /再灌注过程中抗神经元凋亡的作用及机理。方法 采用大鼠局灶脑缺血模型 ,观察脑缺血 /再灌注后皮层钙凋磷酸酶和钙蛋白酶活性的变化。结果 脑缺血 /再灌注可以导致皮层钙凋磷酸酶和钙蛋白酶活性增加 ,葛根素可降低皮层钙凋磷酸酶和钙蛋白酶活性。

钙蛋白酶的结构及活性调节

钙蛋白酶广泛存在于各组织，广泛表达的钙蛋白酶有两种，钙蛋白酶Ⅰ和钙蛋白酶Ⅱ，它们激活所需的Ｃａ２＋浓度不同．这两种酶都有大、小两个亚基，分子质量分别为８０ｋｕ和３０ｋｕ．大亚基有４个结构域，小亚基由２个结构域构成．新近还发现了几种组织特异表达的钙蛋白酶．钙蛋白酶抑制蛋白是钙蛋白酶的内源抑制蛋白，它由５个结构域组成，其中４个为重复序列，均具有独立抑制钙蛋白酶活性的功能．体内钙蛋白酶活性受到严格调控，贴膜反应可以降低钙蛋白酶对Ｃａ２＋的依赖性，膜磷脂头部所带的磷酸基团与激活作用有关，自溶也可以降低对Ｃａ２＋的依赖，而钙蛋白酶抑制蛋白则起专一的抑制作用．

猪钙蛋白酶抑制蛋白基因PCR-RFLP多态性与肉质性状及背膘厚间的关系分析

钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)是钙蛋白酶系统的内源性抑制剂,并且已经被确定能影响宰后肉的嫩度。本研究采用PCR-RFLP技术,分析了CAST基因在125头PIC杂交猪中的多态性分布及其与肉质性状和背膘厚间的相关。结果发现,CAST基因在本研究所检测的位点均具有多态性。进一步分析表明,CASTA2A2基因型个体与其相应的另外两个基因型个体相比肌内脂肪含量有显著差异,CASTB1B2基因型个体对于肌内脂肪含量的影响也有相同的趋势;CASTB1B2基因型个体与其相应的另外两个基因型个体相比背膘厚有显著差异,CASTC1C2基因型个体和CASTD1D2基因型个体对于背膘厚的影响也有相同的趋势。因此可以把CAST基因作为影响猪肉质性状和屠体性状的候选基因。

钙蛋白酶系统研究进展

阐述了钙蛋白酶系统的分类、结构,并且综述钙蛋白酶系统的一般生物学功能及影响因素。

大鼠弥漫性脑损伤中基质金属蛋白酶-9通过激活钙蛋白酶导致细胞凋亡

目的探寻弥漫性脑损伤后酶原型基质金属蛋白酶-9(pro-MMP-9)与细胞凋亡的关系及其机制。方法 84只大鼠随机分为3组:空白组(不做脑室注射)、盐水组(脑室注射生理盐水)和实验组(脑室注射基质金属蛋白酶抑制剂),分别在伤后30min、1h、3h、6h、1d、3d和7d处死大鼠,断头取脑。用TUNEL法检测细胞凋亡,明胶酶谱法检测酶原型基质金属蛋白酶-9(pro-MMP-9)表达;酶学法测定钙蛋白酶活性。结果 pro-MMP-9在30min就有表达,1d时达到高峰,其与细胞凋亡形式相近;钙蛋白酶活性呈现单峰形式,峰值在1d。基质金属蛋白酶抑制剂可调高pro-MMP-9的表达和抑制钙蛋白酶活性(P<0.01),减少细胞凋亡(P<0.01)。结论酶原型基质金属蛋白酶-9升高可导致细胞凋亡,激活钙蛋白酶可能是其通路之一。

原发性肝癌钙粘素E和基质金属蛋白酶检测及临床意义

肝癌的侵袭转移是导致肝癌复发和死亡的重要原因[1-7],已有研究提示E-cadherin与肝癌的肝内播散有关[8];基质金属蛋白酶可以降解胶原,参与包括基膜在内的细胞外基质降解过程,与肿瘤的浸润和转移密切相关.