锦灯笼UPLC-Q-Orbitrap HRMS指纹图谱及抗菌活性的谱效关系

建立不同产地锦灯笼(Physalis Calyx seu Fructus,PCF)的指纹图谱,并进行抗菌活性的谱-效关系研究。采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)建立16批锦灯笼指纹图谱,对共有峰进行归属,并进行聚类热图和主成分分析;检测不同产地锦灯笼提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性,采用灰色关联度分析进行谱效关系的研究。建立的锦灯笼指纹图谱共标定38个共有峰,根据精确的分子离子峰质量数及二级碎片信息,查阅相关文献等发现其中包括了22个蔗糖脂肪酸酯类成分、4个酸浆苦素类成分以及木犀草苷、木犀草素等化学成分;聚类分析和主成分分析将16批锦灯笼均按照不同产地进行了分类。16批锦灯笼提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有较好的抑菌活性,灰色关联分析表明,峰27(关联度≥0.85)对金黄色葡萄球菌的抑菌活性贡献较大,峰37、29、30、19、33、35、31、17、32、20和28(关联度≥0.85)对大肠杆菌的抑菌活性贡献较大,且这些特征峰均为蔗糖脂肪酸酯类化合物,表明蔗糖脂肪酸酯类成分对于锦灯笼发挥抗菌活性具有很大的贡献。通过建立锦灯笼质谱指纹图谱及初步谱效关系,筛选出锦灯笼中对抑菌活性贡献较大的特征峰,为进一步研究锦灯笼的药效成分及药理作用提供参考。

锦灯笼化学成分及生物活性研究进展

锦灯笼为茄科植物酸浆Physalis alkekengi L.var.franchetii(Mast.)Makino的干燥宿萼或带果实的宿萼。秋季果实成熟、宿萼呈红色或橙红色时采收。迄今为止已从锦灯笼中分离鉴别出189种化合物,包括酸浆苦素类、黄酮类、苯丙素类、生物碱类、萜类等化学成分,现代药理学研究表明锦灯笼具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性,本文主要对锦灯笼化学成分及生物活性研究进展进行综述,为锦灯笼的开发和利用提供理论依据。

锦灯笼活性成分的现代药理学研究进展

锦灯笼是茄科植物酸浆Physalis alkekengi L.var.franchetii(Mast.)Makino的干燥果实,又名红菇娘、酸浆、灯笼果等,为药食同源中药。研究表明,锦灯笼具有抗菌、抗炎、镇痛、强心、降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等现代药理活性。本文综述了近年来锦灯笼活性成分的药理作用及作用机制的研究进展,旨在为锦灯笼的临床应用及进一步新药研发奠定基础。

基于溃疡性结肠炎模型探讨锦灯笼提取物的抗炎及抗氧化作用

【目的】探讨锦灯笼提取物对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。【方法】将108只SPF级雄性昆明小鼠随机分为6组:空白对照组(CON)、模型对照组(DSS)、阳性对照组(SET)、锦灯笼提取物低(EPCF-L)、中(EPCF-M)、高剂量组(EPCF-H),每组18只。试验开始后,除CON组外的其余小鼠自由饮用3.0%DSS溶液,CON组小鼠正常饮水,不做任何特殊处理;从第8天起,SET组小鼠灌胃给予柳氮磺吡啶(100 mg/kg),EPCF-L、EPCF-M和EPCF-H组小鼠分别灌胃给予锦灯笼提取物0.25、0.5、1 g/kg,CON和DSS组小鼠以相同的方式给予蒸馏水,每日1次,每只0.2 mL,连续7 d。试验期间每日逐只称量小鼠体重,观察小鼠粪便情况,计算小鼠疾病活动指数(DAI)、结肠黏膜损伤指数(CMDI)及组织病理学变化,测定小鼠结肠组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)及炎性因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1βmRNA表达水平。【结果】与CON组相比,DSS组小鼠体重下降明显,粪便不成型甚至出现血便,DAI评分和CMDI评分显著升高(P<0.05),结肠组织可见大量炎性细胞,肠黏膜结构被破坏,SOD、CAT、GSH-Px活性显著降低(P<0.05),IL-6和IL-1β基因mRNA表达水平显著升高(P<0.05),表明小鼠溃疡性结肠炎模型建立成功。与DSS组相比,结肠组织中炎性细胞浸润、黏膜充血和出血等情况减少,SET、EPCF-M、EPCF-H组的DAI和CMDI评分显著降低(P<0.05),SOD、CAT、GSH-Px活性显著升高(P<0.05),IL-6和IL-1β基因mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。【结论】锦灯笼提取物对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎有治疗作用,其可能途径是提高机体的抗氧化功能及减少炎性因子的产生。

基于锦灯笼对白血病作用机制的网络药理学和分子对接技术的生物信息学分析

目的:基于网络药理学探讨锦灯笼(PCF)在白血病发生发展过程的作用,阐明其生物活性成分主要作用靶点和信号通路相关机制。方法:利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库以“锦灯笼”为关键词检索其生物活性成分及对应的潜在靶点,并采用蛋白质数据库(PDB)和小分子药物靶点预测在线平台(Swiss Target Prediction)网站对其潜在靶点进行评估预测。采用GeneCards、OMIM和DrugBank数据库以“Leukemia”为关键词对相关靶点进行检索。利用Draw Veen Diagram在线软件将PCF生物活性成分靶点与白血病靶点交集,得到的交集靶点即为PCF作用于白血病的靶点;利用基因/蛋白相互作用检索搜查工具(STRING)数据库获取交集靶点蛋白的蛋白-蛋白互作(PPI)网络信息并进行可视化处理;采用注释可视化和集成发现数据库(DAVID)对交集基因进行基因本体(GO)生物功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析,并利用Cytoscape 3.7.2软件对PPI网络进行拓扑分析筛选核心靶点和核心活性成分,采用AutoDock和PyMol软件进行分子对接验证。结果:对TCMSP数据库检索结果进行筛选后得到6个PCF活性成分,收集PCF与白血病的共同靶点29个。GO富集分析主要涉及造血或淋巴器官的发育、蛋白代谢调控和细胞凋亡等生物进程;KEGG信号通路富集分析主要包括癌症通路、肿瘤坏死因子(TNF)和T细胞受体(TCR)等信号通路。拓扑网络分析得到蛋白激酶B1(AKT1)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)等10个核心靶点,结合KEGG信号通路筛选出核心活性成分谷甾醇和禾本甾醇。分子对接,PCF活性成分谷甾醇与原癌基因JUN及禾本甾醇与AKT1和Caspase-3对接能均<-6.0 kcal·mol-1,表明对接较好。结论:PCF的主要活性成分谷甾醇和禾本甾醇可能通过调控JUN、AKT1和Caspase-3等基因参与癌症通路和TCR等信号通路,进而影响白血病的发生发展。

基于UPLC-Q-TOF-MS与网络药理学的锦灯笼配方颗粒抗炎、抗肿瘤有效成分的研究

为探究锦灯笼配方颗粒抗炎、抗肿瘤有效成分及其作用机制,采用UPLC-Q-TOF-MS技术对锦灯笼配方颗粒进行成分分析;筛选锦灯笼配方颗粒抗炎、抗肿瘤作用对应的靶点,构建核心蛋白互作(PPI)网络和活性成分-靶点网络;对关键靶点进行GO和KEGG通路富集分析,采用AutoDock软件进行分子对接验证。结果表明:共鉴定出有机酸类、黄酮类、香豆素类和甾体类等化合物共36个。PPI分析发现TNF、AKT1、IL1β等为锦灯笼配方颗粒抗炎作用核心靶点,AKT1、EGFR、TNF等为抗肿瘤作用核心靶点,GO富集分析发现锦灯笼配方颗粒抗炎、抗肿瘤作用与急性病毒性心肌炎、癌症等信号通路相关。5个核心成分木犀草素、槲皮素、酸浆苦素G、阿魏酸、秦皮乙素与8个核心靶点具有较低的结合能。综上,基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱技术、网络药理学、分子对接技术初步阐述锦灯笼配方颗粒抗炎、抗肿瘤有效成分及作用机制,为锦灯笼配方颗粒药效物质基础研究奠定了试验基础,为其质量控制与临床应用提供了参考依据。

锦灯笼宿萼提取物体外抗菌作用研究

采用纸片扩散法对锦灯笼宿萼提取物进行体外抗菌试验研究，以了解其抗菌谱。结果表明该提取物对金黄色葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌均有抑制作用，而对绿脓杆菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌以及白色念珠菌均无抑制作用，表明锦灯笼宿萼提取物中存在有效抗菌成分，其中以甲链、乙链、金葡菌高度敏感，锦灯笼宿萼精制提取物最低抑制浓度为25～50g／L。

锦灯笼宿萼总黄酮体外抗氧化活性

采用NaNO_2-Al(NO3)_3-NaOH法测定锦灯笼宿萼提取液中的总黄酮含量,采用分光光度法测定锦灯笼宿萼总黄酮提取液的还原力及其对各种自由基、NaNO_2的清除能力。结果表明,锦灯笼宿萼总黄酮提取液对DPPH·、·OH、O-2·、NaNO2、ABTS+·均有一定的清除能力,且随总黄酮质量浓度的升高而增强。质量浓度为0.6mg/mL时,对DPPH·、·OH的清除率分别为89.00%、54.20%;质量浓度为0.12mg/mL时,对O-2·、ABTS+·的清除率分别为58.74%、94.25%,还原力为0.938,与维生素C相当;质量浓度为0.20mg/mL、用量1.8mL时,对NaNO2的清除率为89.49%。

不同产地锦灯笼果实化学成分指纹图谱研究

目的建立锦灯笼果实的HPLC指纹图谱,研究不同产地锦灯笼果实的质量差异。方法应用Agilent TC-18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,以0.2%磷酸水(A)-乙腈(B)为流动相梯度洗脱,柱温:25℃,检测波长:220 nm,流速:1.0ml·min-1;采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)》软件进行相似度评价,并对23批药材进行聚类分析。结果该方法能够很好地分离不同产地锦灯笼果实的主要成分,不同产地锦灯笼果实指纹图谱相似度较高,建立了含有11个共有峰的锦灯笼果实指纹图谱。结论采用HPLC方法建立锦灯笼果实指纹图谱,方法重复性好,可用于锦灯笼果实的质量评价。

超声波协同酶法提取锦灯笼果实多糖工艺的研究

采用超声波协同纤维素酶法提取锦灯笼果实多糖的最佳工艺条件,以多糖提取率为考察指标,通过单因素实验与Plackett-Burman实验设计分析各因素显著性,再采用Box-Behnken中心组合设计原理进行响应面分析优化。实验表明最佳工艺参数为料液比(锦灯笼粉末的质量∶水的体积)1∶15.6g/mL、w(纤维素酶)=3.4%、超声时间30min、酶解时间60min、pH=5.0和超声温度50℃,锦灯笼多糖得率为13.78%,为纤维素酶法联合超声波处理技术在锦灯笼多糖提取过程中的应用提供了理论依据。

超声酶法对锦灯笼中黄酮和木犀草素提取工艺的优化

目的优选锦灯笼中总黄酮和木犀草素的提取工艺。方法以超声波辅助纤维素酶进行提取,研究酶解时间、料液比、酶解温度、酶用量等4个因素对锦灯笼总黄酮提取率的影响。采用UV法和HPLC法,分别测定锦灯笼的总黄酮和木犀草素的含量。结果超声波辅助酶法提取锦灯笼中总黄酮的最佳工艺条件:酶解时间3 h、料液比1∶10(w/v)、酶解温度60℃、纤维素酶用量75 mg/g,在此条件下得到的总黄酮和木犀草素总评分为3.951。结论该提取工艺简便、易行、高效,是提取锦灯笼总黄酮和木犀草素的可行方法,具有一定的推广价值,为进一步开发利用锦灯笼总黄酮和木犀草素提供了理论依据。

微波协同超声波提取锦灯笼多酚的工艺优化

利用微波协同超声波的方法,优化锦灯笼多酚的提取工艺,为锦灯笼多酚的进一步研究提供参考依据。以多酚提取率为考察指标,通过单因素实验与Plackett-Burman实验设计,分析各因素的显著性,再采用Box-Behnken中心组合设计原理进行响应面分析优化。实验结果表明,液料比[V(乙醇溶液)∶m(锦灯笼蓿萼)]对锦灯笼多酚提取率的影响达到显著水平,微波功率、提取时间达到极显著水平。最佳工艺参数为液料比32∶1mL/g、微波功率420W、提取时间180s、φ(乙醇)=50%和超声波功率500W,提取率可达到2.27%。该方法提取率高,便捷,可行。

高效液相色谱法测定锦灯笼药材中维生素C含量

目的:建立一种测定锦灯笼药材中维生素C含量的方法。方法:色谱柱采用Agilent TC-18(4.6mm×150mm,5μm),柱温为25℃,以0.1%草酸水为流动相,流速为0.5 mL.min-1,UV检测器,检测波长为265nm。结果:样品进样量在4.72～23.6μg时呈良好的线性关系(r=0.9997);加样回收率分别为99%和97%,RSD为2.52%和2.12%。结论:本法操作简便,分离效果好。

锦灯笼总黄酮提取工艺的优化研究

目的优选锦灯笼总黄酮的提取工艺。方法以锦灯笼总黄酮的提出量为评价指标,以提取次数、提取时间、固液比为考察因素,采用正交实验法优选锦灯笼总黄酮的提取工艺。结果优化的提取条件为80%乙醇回流提取2次,2 h/次,固液比为1∶8。结论优化的提取工艺简便、合理,可为锦灯笼总黄酮工业化提取提供参考。

锦灯笼宿萼中总多酚超声提取工艺研究

[目的]研究锦灯笼宿萼总多酚的超声提取工艺。[方法]以锦灯笼宿萼总多酚提取率为考察指标,在单因素试验的基础上,采用正交试验对锦灯笼宿萼总多酚的超声提取工艺条件进行优化。[结果]锦灯笼宿萼中总多酚超声提取的最佳试验条件为:提取溶剂为浓度50%乙醇水溶液,料液比为1∶20(g/ml),超声提取时间为30 min,提取次数为2次。[结论]该方法简捷、可靠,可为锦灯笼宿萼总多酚的深入研究与开发提供理论基础。

红菇娘和紫菇娘的组织培养与繁殖

[目的]筛选野生红菇娘(Calyx seu Fructus Physalis)和紫菇娘(Physalis tungkenensis Kuan et Gao)组织培养的最佳培养基。[方法]分别以2种植物的茎、叶为外植体,比较不同取样方式、不同增殖条件及不同生根条件对2种植物组织培养和快速繁殖的影响。[结果]以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.04 mg/L为最适合红菇娘愈伤组织诱导和分化的培养基,而紫菇娘是MS+6-BA 3.0 mg/L和NAA0.03 mg/L,培养14 d后每个愈伤组织能产生3~5个不定芽。继代和生根培养后,丛生芽的成活率为90%以上。[结论]该研究可为2种酸浆属野生种质资源保存和优质种苗生产提供技术参考。

不同产地对锦灯笼药材糖类成分的影响

目的：对不同产地的锦灯笼药材的宿萼及果实的多糖和还原糖进行检测。方法：对采自不同产地的锦灯笼药材,采用分光光度法,经蒽酮-硫酸和3,5-二硝基水杨酸（DNS）显色,于620 nm和540 nm处对锦灯笼药材宿萼及果实的多糖和还原糖含量进行测定,并对所得结果利用SPSS进行数据分析。结果：不同产地锦灯笼药材中的还原糖与多糖含量的系统聚类分析结果打破了其所在区域的划分,糖总量在200~300 mg·g-1。结论：试验所用的检测方法,方便、快捷、结果准确,可以作为今后锦灯笼药材中糖类成分的检测手段,为今后锦灯笼药材的药用价值开发,及果实的保健应用提供一定的理论基础,并为锦灯笼药材资源的品质评价提供一定的依据。

酸浆种质资源调查研究

目的考察酸浆种质资源分布情况。方法直接到酸浆种质分布区域调查收集种质材料,用GPS仪精确定位采样点的地理位置,测定经纬度和海拔高度,对于所采集的每一份种质样本做好详细的记录。结果共进行考察点为95个,其中收集到了酸浆种质的采集点为63个,采集点主要集中在辽宁省、吉林省和黑龙江省。结论酸浆的分布广泛,适应性强,东北三省的酸浆的种质资源非常丰富,根据实地调查,依据宿萼及果实的形态差异,可以划分为多个种质。

锦灯笼花生大豆饮料生产工艺试验

目的：研究锦灯笼花生大豆植物蛋白饮料生产工艺。方法将锦灯笼、花生和大豆经处理磨浆调配成的一种锦灯笼花生大豆复合植物蛋白饮料。结果豆浆：锦灯笼汁：花生浆经正交试验得出最佳配比为豆浆40%，锦灯笼汁11%，花生浆5%；pH为7.5~8.0添加0.2%复合稳定剂(羧甲基纤维素钠(CMC)：果胶：黄原胶=1：1：1)可增加成品的胶粘性，使饮料稳定性好，口感俱佳，饮料成品呈弱碱性。结论锦灯笼花生大豆饮料风味影响因素进行三因素三水平正交试验，由极差分析可知，主次顺序是锦灯笼汁〉豆浆〉花生浆，即锦灯笼汁量对产品质量影响最大，其次是豆浆。最佳配比：豆浆：锦灯笼汁：花生浆=40：11：5；添加复合稳定剂(羧甲基纤维素钠(CMC)：果胶：黄原胶=1：1：1)，可增加成品胶粘性，稳定性好，口感俱佳；通过感观品尝，二次杀菌状态比较，确定 pH 为7.5~8.0。

HPLC法同时测定锦灯笼果实中5种成分及等级鉴定

目的建立HPLC同时定量测定锦灯笼果实中木犀草苷、木犀草素、酸浆苦素A、酸浆苦素P和酸浆苦素O的方法并选择分级标准的测试成分。方法利用Agilent TC-18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱分离,乙腈-0.2%磷酸进行梯度洗脱,体积流量为1.0 mL/min,切换波长,0～24 min(350 nm),24～37 min(220 nm)。结果木犀草苷、木犀草素、酸浆苦素A、酸浆苦素P、酸浆苦素O分别在0.052～0.26μg/mL(r=0.999 5),0.04～0.2μg/mL(r=0.999 5),0.048～0.24μg/mL(r=0.999 6),0.04～0.2μg/mL(r=0.999 7),和0.36～1.8μg/mL(r=0.999 7)范围内线性关系良好,平均回收率大于98%。结论由于木犀草素、酸浆苦素P和O含有量过低,故以木犀草苷和酸浆苦素A为分级标准的测试成分是合理的。