TAIL-PCR方法快速克隆银杏查尔酮合成酶基因及序列分析(英文)

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法已广泛应用于从多种生物克隆已知DNA序列的侧翼序列。对传统的TAIL-PCR方法进行改良:(1)将TAIL技术应用于TAIL-PCR中第3步PCR循环。(2)以10bp的随机简并引物即RAPD引物代替基因侧翼简并引物。以银杏品种家佛手的叶基因组DNA为模板,利用简并引物克隆到银杏查尔酮合成酶基因(CHS)片段序列Gbchs1,以此序列设计3条特异引物,利用改良的热不对称交错PCR方法克隆到CHS基因Gbchs2。结果表明,Gbchs2长1238bp,编码304个氨基酸并包含3’末端序列。GbCHS2蛋白质序列与其他植物的CHS蛋白质序列高度同源,包含CHS蛋白质保守的环化作用活性位点,催化活性位点、香豆素活性位点、及催化活性基序。改良后的TAIL-PCR方法为基因全长的克隆提供了一种简单快速高效的新方法。

金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究

利用RT-PCR和RACE技术,从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的cDNA全长,命名为Cn-CHI,GenBank登录号HQ269805.1。碱基序列分析表明,Cn-CHI基因全长953bp,包含56 bp的5’非翻译区、204 bp的3’非翻译区和一个长为693 bp编码230个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列比对分析表明,Cn-CHI基因编码蛋白与蔷薇科、杜鹃花科、茄科等植物的CHI蛋白同源性都在75%以上,与山茶科山茶属茶树CHI蛋白同源性高达99%。相对荧光定量PCR分析表明,Cn-CHI基因在金花茶花蕾发育过程中呈现先急剧上升后平缓下降的趋势;在花器官的不同部位中,Cn-CHI基因表达量最高的是雌蕊,其次是雄蕊,在萼片和花瓣中的表达量较低且相差不大。

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列。序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1650bp,含一个462bp的内含子;其cDNA编码区全长1188bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。

甜荞查尔酮合酶基因Chs的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术从甜荞中克隆得到查耳酮合酶（CHS）的cDNA开放阅读框（ORF）序列,命名为FeChs,NCBI登录号为GU172166.1。该序列长1 179 bp,编码392个氨基酸,与其它植物CHS基因的同源性为78%~92%,其推导的氨基酸序列含有CHS高度保守的活性位点及CHS的标签序列GFGPG。

苦荞查尔酮合酶基因FtCHS1启动子的克隆及分析

采用染色体步移技术,从苦荞(Fagopyrum tataricum Gaertn.)中克隆获得Ft CHS1基因5'端侧翼序列,共1038 bp,将其命名为PFt CHS1。生物信息学分析表明,PFt CHS1中A/T碱基含量为63.5%,含有4个可能的转录起始位点,分别位于起始密码子上游-684^-734、-692^-742、-920^-970、-929^-979 bp处,该序列包含TATA-Box和CAAT-Box等启动子核心元件以及与光、低温和激素应答等相关的功能元件。本研究进一步构建了PFt CHS1-p BI101植物表达载体,并瞬时转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)叶片,结果显示该序列可驱动GUS报告基因的表达。低温(4℃)和光照(UV-B)处理苦荞幼芽后,采用荧光定量PCR技术分析Ft CHS1基因的表达量,结果表明PFt CHS1可响应低温和紫外环境胁迫,从而引起Ft CHS1基因表达量发生变化。

茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析

茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一,含有许多有价值的次生代谢产物,如儿茶素类物质。分离和克隆重要的茶树功能基因,对利用基因工程技术进行茶树遗传调控具有重要意义。本文采用EST测序技术和T4RNA连接酶介导的5′RACE技术,获得了一个茶树儿茶素代谢中的重要基因—查尔酮异构酶(CHI)基因,在GenBank登录(DQ904329),其序列全长1163bp,其中开放阅读框长723bp,编码240个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为26.4kD,理论等电点为5.19。序列分析表明它与番茄CHI基因序列的亲缘关系比较近。

油茶查尔酮合酶和异构酶基因的cDNA克隆

查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了1条查尔酮合酶基因全长cDNA和1条查尔酮异构酶全长cDNA.结果表明:油茶查尔酮合酶基因的cDNA含1479 bp,编码412个氨基酸,为目前最长的查尔酮合酶,与其它物种的查尔酮合酶具有极高的相似性,在进化上高度同源;油茶查尔酮异构酶基因的cDNA含899 bp,编码206个氨基酸,与茶的查尔酮异构酶基因高度同源,但与其它物种的相似性较低.

非洲菊查尔酮合酶基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

利用RT-PCR方法,从非洲菊(Gerberahybrida)花瓣的cDNA中克隆到了查尔酮合酶(ChalconeSynthase,CHS)基因CHS,进行了序列分析。结果表明,克隆到的CHS基因全长为1197bps,编码一个由398个氨基酸残基组成的多肽,与Helariutta等发表的非洲菊查尔酮合酶CHS1基因的cDNA序列的CHS基因同源性高达99%。进一步将该基因克隆到表达载体pET32a上,经IPTG诱导表达,得到高效表达的融合蛋白。

金花茶查尔酮合成酶基因全长克隆与序列分析

利用RT-PCR和RACE方法,从我国珍稀植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中获得了查尔酮合成酶(chalconesynthase,CHS)基因的cDNA全长,命名为Cn-CHS,GenBank登录号HQ269804。碱基序列分析表明,Cn-CHS全长1 454bp,包含77 bp的5′非翻译区、207 bp的3′非翻译区和一个长为1 170 bp编码389个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有CHS家族保守存在的所有功能活性位点和特征性多肽序列。氨基酸序列比对分析表明,Cn-CHS与蔷薇科、杜鹃花科、茄科等植物的CHS相似性都在92%以上;与山茶科山茶属物种山茶(C.japonica)CHS完全一致;与茶(C.sinensis)CHS相似性达99%,有5个氨基酸位点存在差异,其中包括一个功能性位点。

金花茶异戊烯焦磷酸异构酶基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

为深入研究金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子机理,在成功提取金花茶花瓣总RNA的基础上,利用同源克隆和RACE技术克隆得到了异戊烯焦磷酸异构酶基因的cDNA序列全长,命名为CnIPI。碱基序列分析表明:CnIPI基因全长916bp,包含有一个长度为747bp编码248个氨基酸的开发阅读框。生物信息学分析表明:该基因编码的CnIPI蛋白质分子量为27.97kD,为稳定亲水性蛋白,无信号肽;CnIPI蛋白的二级结构以无规则卷曲为主,β-折叠所占比例最少;CnIPI蛋白含有一个典型的异戊烯焦磷酸异构酶结构域。氨基酸序列同源性分析结果表明:CnIPI蛋白与茶、月季、杜鹃等植物IPI蛋白的同源性高于86%。CnIPI基因的克隆使全面理解金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子途径取得了新的突破,为进一步深入研究CnIPI基因的功能及金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子机理奠定了良好的理论基础。

红花檵木CHS基因的克隆与序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的第1个关键酶。根据植物查尔酮合成酶保守区序列设计引物,以红花檵木(Loropetalurn chinense var.rubrum)大叶红的嫩叶为材料,用RT-PCR方法,分离得到了一个查尔酮合成酶基因的cDNA(GenBank登录号为JQ609678),将该基因命名为LcvrCHS1。该序列长927bp,编码232个氨基酸残基。其核苷酸序列与GenBank已登录的同样来源的核桃、山茶属植物CHS序列同源性达83%,与其他科植物(绣球花、葡萄、桃、马铃薯、甘草、领春木属)CHS序列同源性也达到80%以上;其编码的氨基酸序列与山茶属、葡萄、鳄梨、洋梨、沙梨、映山红CHS基因编码的氨基酸序列同样具有高度同源性,同源性高达98%。

青花菜查尔酮合成酶基因BoCHS的克隆、表达及序列分析

根据NCBI数据库中发布的查尔酮合成酶基因序列设计PCR简并引物,以青花菜(Brassica oler-acea var.italica)子叶cDNA为材料,克隆到了青花菜查尔酮合成酶基因,基因命名为BoCHS,序列已提交到NCBI数据库,登录号为GU266209。该基因的编码区全长为1182bp,编码393个氨基酸。序列比对结果表明,BoCHS基因编码的氨基酸序列与其他十字花科植物之间的同源性很高,仅存在个别氨基酸残基的差别。RT-PCR检测表明,经霜霉病菌(Hyaloperonospora parasitica)侵染后,子叶中BoCHS的表达量增加,其中以72h和96h的表达量最大。

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT-PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因——黄酮醇合成酶(FLS)基因,在GenBank登录(GenBank accessionNo.EF205150),其序列全长1317bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3'端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5kD,理论等电点为5.80。序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础。

诸葛菜(Orychophragmus violaceus)查尔酮合成酶基因OvCHS的克隆与序列分析

根据GenBank发布的基因序列,设计PCR引物,分别从诸葛菜(Orychophragmus violaceus)的花瓣基因组DNA和cDNA克隆到查尔酮合成酶基因,并定名为OvCHS,序列已上传至NCBI数据库,登陆号为EF408918。序列分析表明,OvCHS基因的基因组全长为1263 bp,具一个75 bp的内含子,编码区全长为1188 bp,编码395个氨基酸。与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)查尔酮合成酶基因AtCHS比较发现,两基因编码区有135个碱基不同,相似性为88.64%,氨基酸序列中仅16个氨基酸残基的差异,相似性达95.95%。

决明查尔酮合成酶全长基因序列的克隆与分析

从决明(Cassia tora)的新鲜子叶中提取基因组DNA作为模板,利用一对特异引物进行PCR扩增,然后克隆测序得到决明查尔酮合成酶(CHS)的基因全长。测序结果表明,决明CHS基因全长为1 766 bp,含有2个外显子和1个内含子。将其提交GenBank,登录号为(JX676773)。决明CHS基因的内含子位于188-765 bp之间,长度为578 bp,内含子的剪切符合GU-AG规律,含有多个酶切位点和顺式调控元件,可能与决明CHS基因的表达调控有关。CHS基因内含子具有多态性,可能是由不同植物存在多样性的生活史与生活环境导致的。决明CHS基因外显子2较为保守,编码几乎所有CHS的功能位点。构建外显子2编码氨基酸序列的NJ系统发育进化树,能够正确反映不同植物的亲缘关系,可用于不同植物的遗传分化和分子进化研究。

用SON-PCR快速获得长鞭红景天CHS基因全长及其序列分析

采用单侧寡聚核苷酸嵌套PCR(SON-PCR)方法,从长鞭红景天中扩增得到查尔酮合成酶基因(chalcone synthase,CHS),命名为Rhchs,其序列全长为2 443 bp,包括682 bp的启动子区、957 bp的开放阅读框和3′UTR区。预测序列编码381个氨基酸,其氨基酸组成与其他已知的高等植物的查尔酮合成酶具有很高的同源性,与葡萄、山茶花、杜鹃和牵牛的同源性分别为87%、87%、86%和85%。且大部分氨基酸序列保守。序列分析表明,在启动子区域也找到了TATA-box、W-box、G-box like等顺式作用元件。

油橄榄查尔酮合酶与查尔酮异构酶基因全长的克隆及序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase,Chs)与查尔酮异构酶(chalcone isomerase,Chi)是植物类黄酮合成代谢途径中的两个关键酶。采用同源克隆、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、融合引物嵌套PCR(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)与3’-c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA end,RACE)相结合,分别克隆出油橄榄chs与chi基因全长。序列分析表明,油橄榄chs基因全长DNA(Gen Bank登录号:KF935223.1)和c DNA(Gen Bank登录号:KF935224.1)序列分别为2 085 bp和1 173 bp,该基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)编码390个氨基酸,其氨基酸序列与葡萄和番茄全长Chs氨基酸序列的相似度在90%左右。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白属于Chs蛋白家族。油橄榄chi基因全长DNA(Gen Bank登录号:KF886190)和c DNA(Gen Bank登录号:KF886191)序列分别为1 373 bp和750 bp,其ORF编码249个氨基酸,该氨基酸序列与已报道的其他植物Chi氨基酸序列的相似度最高在65%左右,序列中包含一段由198个氨基酸残基组成的具有分子内裂解酶活性的功能域,符合Chi蛋白家族特征。

显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因cDNA克隆及蛋白质序列分析

目的对显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata查耳酮合成酶(CHS)基因进行克隆及序列分析。方法根据已经克隆的植物基因的保守序列设计一对引物,以显齿蛇葡萄总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果得到一段1 173 bp的序列,序列分析表明,该片段编码390个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在67.9%以上。结论首次从显齿蛇葡萄中克隆了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。

黄蜀葵查尔酮合成酶基因AmCHS克隆及序列分析

从黄蜀葵(Abelmoschus manihot)花瓣中通过简并引物克隆得到查尔酮合成酶基因cDNA核心序列,根据核心序列设计特异引物,再应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得黄蜀葵查尔酮合成酶基因(AmCHS)cDNA全序列.序列分析结果表明AmCHS cDNA编码区长1170 bp,编码389个氨基酸.其氨基酸序列与其它已知高等植物CHS基因具有很高的同源性,并且包含了CHS具有的活性位点和催化位点等保守性位点.

鱼腥草查耳酮合成酶1基因cDNA克隆、差异表达及其蛋白质序列分析

目的克隆鱼腥草查耳酮合成酶1(CHS1)基因并分析其蛋白质序列。方法根据已经克隆的植物CHS基因的保守序列设计一对引物,以鱼腥草总RNA为模板,采用RT-PCR和SON-PCR的方法快速获得CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果得到一段1 188 bp的序列,序列分析表明,该片段编码395个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在62.3%以上,生物信息学分析表明,该蛋白含有CHS家族的特征多肽序列"RLMMYQQGCFAGGTVLR"和"GVLFGFGPGL",不含信号肽序列。相对荧光定量PCR分析表明,CHS1基因在花中的表达量最高,其次是地上茎,再次是地下茎,叶片中表达量最低。结论首次从鱼腥草中克隆了CHS1基因,为有效利用该基因奠定了基础。