喜树中一株特异产喜树碱内生真菌Aspergillus niger GP3的分离与鉴定

目的:从喜树内生真菌中筛选出具有产喜树碱潜力的菌株,为获得喜树碱提供一条新的药源途径。方法:从喜树根皮分离内生真菌,综合利用高效液相色谱法(HPLC)以及超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-Orbitrap-MS/MS)法对内生真菌次生代谢产物有效活性成分进行分析,并通过形态学和分子学对其特异性真菌进行鉴定。结果:内生真菌GP3具有产喜树碱的化学性质,其菌落圆形、黑褐色、中心凸起、边缘呈纤毛状,经ITS序列比对,该菌与Aspergillus niger ITS序列相似性为99%。结论:GP3是一株具有产喜树碱潜力的内生真菌菌株,鉴定为黑曲霉菌(Aspergillus niger)。

喜树内生真菌的分离及其对植物病原菌的抑菌活性测定

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从喜树的枝条、叶片、果实和根中分离获得28株内生真菌。对峙试验结果显示,28株内生真菌对6种植物病原菌均有不同程度的抑制作用;其中G-4菌株作用最明显,对苹果腐烂病菌(Valsa mali miyabeet Yamada)、茄褐纹病菌[Phomopsis vexans(Sacc.et Syd.)Harter]的抑制率分别为89.68%和83.88%。对G-4菌株生物学特性测定结果表明,G-4菌株生长最适温度为28℃,最适pH范围为6.4～8;在麦芽浸粉培养基上G-4菌丝生长迅速;果糖为最佳碳源。

一株喜树内生真菌的分离及其产喜树碱的初步分析

从秦巴山区喜树中分离到42株内生真菌,其发酵产物经HPLC检测发现,菌株M-20氯仿-甲醇提取物的出峰时间为5.314 min,同喜树碱标准品的出峰时间(5.453 mim)靠近。HPLC-MS分析显示,菌株M-20产生一个M+H+核质比为349.4的离子峰,喜树碱标准品的M+H+核质比为349.2。上述结果表明,菌株M-20代谢产喜树碱,含量为233.3μg/L。结合形态特征和ITS序列分析,将菌株M-20初步鉴定为炭角菌属(Xylaria)真菌。

接种后共培养时间对丛枝菌根喜树幼苗喜树碱含量的影响

在前期工作中利用蜜色无梗囊霉(Acaulospora mellea)和根内球囊霉(Glomus intraradices)从接种时期角度分析了喜树碱含量与菌根形成过程对应关系的基础上,通过温室盆栽接种试验,继续观察了这两种丛枝菌根真菌接种后与喜树(Camptothecaacuminata)幼苗的共培养时间对喜树幼苗喜树碱积累的影响。分别用两种菌根真菌每隔7d接种一批喜树幼苗,第5批接种7 d后采样,获得菌根真菌与喜树幼苗共培养时间分别为35、28、21、14、7 d的喜树幼苗样品,测定了菌根浸染状况和喜树碱含量。结果表明:(1)接种两种丛枝菌根真菌均促进了喜树幼苗喜树碱的积累,表现为喜树碱含量和产量(单株幼苗所含的喜树碱量,喜树碱含量与幼苗生物量的乘积)的显著提高。(2)从接种后共培养时间的效果看,两种菌根幼苗各器官(根、茎、叶)及全株喜树碱含量和产量均呈现随着丛枝菌根真菌与喜树幼苗共培养时间的增加而增加的趋势。两种菌根幼苗的根和茎、根内球囊霉菌根幼苗的叶片和全株的的喜树碱含量和产量,在共培养时间增加至21 d时趋于稳定,而蜜色无梗囊霉菌根幼苗的叶片和全株的喜树碱含量和产量在共培养时间增加至28 d时达到最高,其后略有降低。(3)两种丛枝菌根真菌的侵染率和侵染强度同样随共培养时间的增加而增加,至共培养28 d后无显著变化。在一定共培养时间范围内,喜树碱含量和产量的变化与丛枝菌根真菌的侵染及菌根形成之间具有对应性。

喜树内生真菌的分离及其抗肿瘤活性菌株的筛选

以中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)株作为模型,用Resazurin法检测生长抑制率,对197株喜树内生真菌次生代谢产物进行体外抗肿瘤活性试验。结果发现,不同采集部位及不同地理环境分离出的菌株抗肿瘤活性有明显差异,其中以树皮中分离出的内生真菌具有抗肿瘤活性的比例最高。从采集的地理位置分析,由安徽黄山标本所分离的内生真菌抗肿瘤活性菌株比例高于其他2个采集地点。1株从黄山喜树果实上分离的菌株对CHO细胞的抑制率超过50%,初步鉴定为Rhizopycnis属真菌。

喜树内生真菌的分离及其抗肿瘤活性代谢产物的筛选方法

从喜树(CamptothecaacuminataDecne.)的根、枝条、叶和果实中分离纯化了48株内生真菌,通过对各个菌株的少量发酵培养,HPLC分析结合色谱峰紫外扫描检测方法,以紫外扫描图谱的相似性为依据,对喜树内生真菌产生喜树碱结构类似物进行初步筛选,并进一步以抑瘤实验确证其抗肿瘤活性。结果证明,以该方法筛选到的10个内生菌株中有7个菌株发酵液对HL 60细胞增殖具有显著的抑制活性。相对于常规的生物活性筛选,高效液相色谱结合色谱峰紫外光谱的方法,在药用植物内生真菌活性次生代谢产物筛选研究中具有快速、高效的特点。

具有生物碱转化活力的4株喜树内生真菌的鉴定

从喜树(Camptotheca acuminata Decne)的根、枝条、叶和果实中分离纯化了48株内生真菌,其中菌株J-3、J-4J、-5、J-8对盐酸罂粟碱、硫酸长春碱等天然活性产物具有转化能力。采用PCR技术对这4株真菌rD-NA的ITS区进行扩增、测序,得到4株真菌的ITS序列,用Blast调出与菌株ITS同源的序列,用DANMAN6.0软件中的Multiple Sequence Alighment进行同源性分析,构建系统进化树,并辅以生理形态指标进行种属鉴定。菌株J-3J、-4分别鉴定为Phomopsis acuminata J-3和Phomopsis acuminata J-4;J-5鉴定为Phomopsis acuminataJ-5;J-8鉴定为Phomopsis acuminata J-8。上述工作为充分利用药用植物内生真菌对天然活性产物进行微生物转化,丰富天然化合物类型并进行构效关系的分析提供了基础。

喜树果内生真菌的分离与鉴定

从喜树(CamptothecaacuminataDecne.)果实中分离、纯化得到5株内生真菌,经初步鉴定,分别属于半知菌亚门的匙孢霉属(MystrosporiumCda.)、鲜壳孢属(ZythiaFr.)及无孢类群(MyceliaSterilia)。其内生真菌经摇瓶培养后,采用薄层层析(TLC)法对其菌丝体提取物进行分析,初步表明WZ001菌株可能产生喜树碱(Camptothecin,CPT)的类似物。

喜树内生真菌抗水稻纹枯病菌活性的研究

从喜树健康组织叶、茎以及果实中经过分离、纯化共得到26株内生菌株。利用生长速率法测定这26株菌株对植物病原菌——水稻纹枯病病原菌的抑制作用。抑菌试验结果显示:26株菌株中有22株喜树内生真菌的发酵液对植物病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用;其中,菌株XSY10的发酵液抑菌效果最强,达到了74.97%。水稻盆栽试验结果表明:喷施菌株XSY10次生代谢产物7d后,对水稻纹枯病的防治效果为34.77%。以上试验结果说明喜树内生真菌XSY10对植物病害的防治具有一定的功效。

喜树内生菌与喜树碱的关系

通过对喜树幼苗中喜树碱含量的分析 ,发现不同生长期、不同器官中喜树碱的含量不同 ,幼叶和根中喜树碱的含量较高 .虽然喜树中含有对真核细胞具有毒性作用的喜树碱 ,但仍有 1 2种内生菌从喜树的不同器官中分离出来 .内生菌对喜树碱的敏感性实验表明 ,1 0μg/ m L喜树碱对 2种内生菌的生长几乎没有抑制作用 ,即是 1 0 0μg/m

喜树内生真菌产喜树碱菌株的筛选及药化研究

采用PDA培养基对151株喜树内生真菌进行发酵,未筛选出产喜树碱及其类似物的内生真菌,而采用喜树种子煎汁作为诱导物进行诱导培养,即在PDA培养基中加入了喜树种子的煎汁,结果从151株内生真菌中共筛选到4株能产生喜树碱及其类似物的内生真菌,其中产喜树碱的3株,产10-羟基喜树碱的1株。试验筛选出了能产喜树碱及其类似物的内生真菌。

喜树内生真菌的研究进展

介绍了喜树内生真菌的生物活性代谢产物,对其内生真菌的生物多样性及其与寄主植物的关系进行了综述,并对喜树内生真菌的研究方向进行了展望。

喜树内生真菌的分离、鉴定以及抗植物病原菌活性的初步研究

对喜树植株中的内生真菌进行分离纯化,共得到126株内生菌株。对126株内生菌株进行液体培养,并对其发酵产物进行抗菌活性测定。发现在供试质量浓度为5 mg/mL时,126株菌株中有24株喜树内生真菌的发酵液对水稻纹枯病菌、稻瘟病菌以及辣椒疫霉具有不同程度的抑制菌丝生长的活性作用;其中,菌株XSY09的发酵液对此三种植物病原菌有明显的抑制作用,抑制率分别为74.97%、39.63%和58.49%。在0.1 mg/mL的测试浓度下,菌株XSY09发酵液的乙酸乙酯相对三种植物病原菌均有较好的抑制作用。对该菌株的ITS序列进行测序分析,初步鉴定XSY09为炭疽菌属(Colletotrichum gloeosporioides)真菌。

基于喜树碱生物合成的喜树内生菌及其关键酶基因克隆

以喜树内生菌为研究对象,经发酵培养后提取喜树碱及其衍生物,采用HPLC法对发酵液中喜树碱及其衍生物进行定性检测,获得能够产生喜树碱(CPT)及10-羟基喜树碱(HCPT)的喜树内生菌。通过对喜树碱生物合成途径的研究,选取10-羟基香叶醇羟化酶(G10H)、10-羟基香叶醇脱氢酶(HGO)、色氨酸脱羧酶(TDC)和异胡豆苷合酶(STR)4个关键酶基因作为研究对象,设计特异性引物,克隆目的基因。提取喜树RNA,经反转录合成cDNA,同时提取喜树内生菌DNA。分别以植物cDNA和内生菌DNA作为模板,筛选鉴定喜树碱合成途径的关键酶基因G10 H、HGO、TDC和STR并与喜树关键酶基因进行比较,初步解析喜树碱代谢途径,为喜树内生菌发酵合成喜树碱及其衍生物提供理论依据。

产抗肿瘤活性物质喜树内生菌分离鉴定

[目的]从药用植物喜树(Camptotheca acuminate Decne.)中筛选产抗肿瘤活性物质的内生菌。[方法]从喜树不同部位分离纯化喜树内生菌,对其发酵液进行HPLC检测,筛选产生喜树碱(Camptothecin,CPT)和10-羟基喜树碱(Hydroxyamptothecin,10-OH-CPT)的菌株,采用MTT法检测其体外抗肿瘤活性。对抗肿瘤活性强的菌株进行菌落观察、显微镜检及ITS序列分析,鉴定菌种。[结果]从喜树分离出内生菌72株,其中4株真菌代谢过程产生喜树碱或10-羟基喜树碱,以人肝癌细胞(HEP-G2)增殖抑制率为指标,结果发现菌株CS-16代谢产物对HEP-G2细胞增殖抑制率最高,达到83.76%。菌种鉴定结果为泡盛曲霉(Aspergillus awamori Nakaz.)。[结论]菌株CS-16发酵过程中可以产生10-羟基喜树碱396μg/L和喜树碱973μg/L,且对人肝癌细胞HEP-G2的增殖抑制率最高,试验结果对开发产生抗肿瘤药物的药用植物内生菌具有较大的研究价值。

产喜树碱内生真菌的筛选及鉴定

从喜树Camptotheca acuminate树皮和果实中分离得到27株内生真菌,发酵后经HPLC检测,筛选出一株菌丝产喜树碱的菌,产量达774μg/L。对其ITS序列进行系统发育分析,结合其培养特征和显微特征,鉴定为拟茎点霉属(Phomopsis sp.)。这是首次报道分离自喜树的该属真菌发酵产喜树碱。

一株喜树内生菌的分离与发酵试验

喜树碱是从喜树(Camptotheca acuminata Decne.)里提取的一种抗癌药物。但由于喜树中喜树碱的含量十分低,喜树碱的获取十分困难。在这个研究中,我们采用了组织块法从喜树的果实、树皮、叶片中分离筛选能够生产喜树碱的内生真菌,一共从分离得到了15株菌株。经过摇瓶发酵培养后,用TLC法与HPLC法对其菌丝体提取物进行分析,发现有1株菌株能够产生喜树碱(Camptothecin,CPT),其喜树碱产量为227μg/L。且该菌株在常规的PDA液体培养基中易于培养、生长迅速,表明该菌是一株优良的喜树碱产生菌。

产喜树碱的喜树内生真菌Aspergillus sp.LY013的分离、退化及退化后的次级代谢产物（英文）

为寻找喜树碱产生菌,从喜树内皮中分离得到50株内生真菌.采用HPLC-DAD分析、筛选这些内生真菌的发酵产物,并进一步采用HPLC-DAD-HRMS确证喜树碱的产生.结果表明,其中一株编号为LY013的内生真菌具有产喜树碱的能力.根据LY013菌株的生长形态、菌丝体和孢子分析,将其鉴定为Aspergillus sp.LY013.在后续进行的传代培养研究中,发现LY013生产喜树碱的能力在传代过程中迅速退化.为了进一步了解LY013的化学成分背景,对该菌株的次级代谢产物进行了深入研究.从LY013的发酵产物中,共分离获得9个复杂生物碱.综合运用波谱方法和相关化学技术,将这9个复杂生物碱鉴定为pseurotin A(1)、FD-838(2)、fumitremorgin C(3)、tryprostatin B(4)、cyclotryprostatin B(5)、12,13-dihydroxyfumitremorgin C(6)、spirotryprostatin A(7)、fumiquinazoline J(8)和fumiquinazoline C(9).上述结果为进一步研究Aspergillus sp.LY013奠定了基础.