念珠菌优势抗体检测方法的建立及临床诊断价值评估

目的侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis,IC)是免疫功能损伤或低下患者常见的感染和死亡原因,近年来检测IC患者血清中特异性抗体的血清学诊断方法成为研究热点。本文旨在建立检测念珠菌烯醇化酶(Enolase,Eno)、果糖二磷酸醛羧酶(fructose-bisphosphate aldolase,Fba1)特异性抗体的ELISA方法,评估其在IC早期诊断中的应用价值。方法利用基因重组技术获得的Eno、Fba1重组蛋白作为包被抗原,建立测定人血清相应抗体的ELISA,并对方法的敏感性、特异性进行考查。结果建立了检测IC患者血清抗Eno、抗Fba1抗体的ELISA,cut-off值分别为吸光度(A)值0.370和0.610。ELISA结果显示,IC患者血清中的抗Eno、抗Fba1抗体水平明显高于健康对照和非IC患者对照(P<0.001)。抗Eno和抗Fba1对诊断IC的敏感性和特异性分别为72.3%(73/101)和98%(196/200),87.1%(88/101)和96%(192/200),联合检测可提高敏感性至91.0%。且与细菌感染及其他真菌感染患者(如曲霉病)无交叉反应。IC患者中40.6%(41/101)可以在血培养阳性前检测到抗Eno、49.5%(50/101)可以在血培养阳性前检测到抗Fba1。结论建立了检测抗Eno、抗Fba1抗体的ELISA法,检测念珠菌菌丝相分泌蛋白IgG抗体特异性和灵敏度良好,在念珠菌感染诊断中具有潜在临床应用价值。

抗白色念珠菌鸡卵黄抗体(IgY)的研制

目的 观察鸡蛋黄中抗体的产量、纯度、来源及稳定性。方法 应用白色念珠菌作为抗原免疫 2 5周龄Leghorn鸡 ,通过改良水溶法 (WD)提取蛋黄中抗体IgY ,双紫外光测定抗体含量 ,SDS PAGE电泳检测抗体纯度 ,Westernblot免疫印迹法测定该抗体来源 ,ELISA检测热处理后的抗体活性。结果 抗体含量 13mg/ml蛋黄液 ,抗体纯度达到 95 % ,Westernblot免疫印迹证明该抗体与鸡血清中的IgG具有相同的分子量和抗原性。ELISA检测热处理后的抗体活性 ,其具有良好的热稳定性。结论 鸡蛋黄内含有丰富的抗体 ,通过WD水溶提取法可得到高产量 ,高纯度的特异性抗体IgY ,证明其来源于鸡血清中的IgG 。

抗白色念珠菌IgY的稳定性与应用研究

目的 观察抗白色念珠菌鸡蛋黄抗体IgY的稳定性与体外生物学效应。方法 用水溶法从免疫鸡蛋黄中提取抗白色念珠菌抗体IgY ,ELISA法检测抗体耐热、耐酸、耐碱的稳定性 ,观察IgY抑制白色念珠菌生长和抑制白色念珠菌粘附肠上皮细胞(IEC 6)。结果 IgY在巴氏消毒后活性为对照的 61 % ,在pH 7 0至 3 0酸性环境中活性改变不显著 ,在pH 7 9,37℃作用 1 50min活性仍为对照的 60 %。IgY在 1 0mg/ml时能明显抑制白色念珠菌生长和对肠上皮细胞的粘附 ,明显降低细胞上清二胺氧化酶(DAO)释放。结论 鸡蛋黄抗体IgY具有高度稳定性和良好的体外生物学效应。

抗白念珠菌芽管单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其对血清芽管诱导率的影响

目的制备并鉴定抗白念珠菌芽管单克隆抗体杂交瘤细胞株,观察该单抗对白念珠菌菌相转换的影响。方法白念珠菌ATCC-90028标准株带芽管孢子做抗原,运用细胞融合技术,制备抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,并鉴定。将该单抗参与白念珠菌芽管血清诱导,对比其芽管诱导率与血清芽管诱导率。结果建立1株持续分泌抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株M cAb03.2C1-C2。其小鼠腹水单克隆抗体效价达1∶25 600;抗体重链属IgG1亚类,轻链属λ型;证实M cAb03.2C1-C2的靶位是位于白念珠菌芽管胞壁外膜上分子量为156kD的抗原成分。间接免疫荧光(IIF)可见单抗能与白念珠菌芽管特异性地结合,与白念珠菌的孢子相不发生反应。单抗能明显降低芽管诱导诱导率。结论本研究建立的M cAb03.2C1-C2对白念珠菌致病相-芽管有高度的特异性,为早期、快速地诊断系统性白念珠菌感染提供了新的前景。M cAb03.2C1-C2对菌相转换有明显的抑制作用,可能在抗白念珠菌系统性感染中起保护性作用。

IgY与双歧杆菌防治小鼠白色念珠菌感染的研究

目的 观察特异性抗白色念珠菌鸡蛋黄抗体IgY和双歧杆菌的体内生物学效应 ,探讨将二者复合应用的可能性。方法 建立无特殊病原菌 (Specificpathogenfree ,SPF)小鼠烧伤后口服白色念珠菌感染模型 ,应用活菌计数方法检测其回肠膜粘附白色念珠菌量、盲肠内容物白色念珠菌量以及白色念珠菌脏器移位率。结果 烧伤SPF小鼠喂服IgY和双歧杆菌后 ,均能明显抑制肠道内白色念珠菌生长和白色念珠菌粘附肠上皮细胞 ;二者复合应用后还能明显降低脏器白色念珠菌移位率。结论 特异性鸡蛋黄抗体IgY具有良好的体内生物学效应且优于单独使用双歧杆菌 。

抗白念珠菌鸡卵黄抗体的制备及温度对其效价的影响

目的:制备抗白念珠菌鸡卵黄抗体(IgY)并检测其生物学性能。方法:白念珠菌标准菌株10231灭活后作为抗原免疫25周龄产蛋海蓝鸡,从水溶法提取鸡卵黄IgY抗体。用考马斯亮蓝染色法测定IgY抗体提取液的蛋白浓度。用Tris-tric ine电泳测定提取蛋白的相对分子质量、纯度,W estern b lot确定蛋白来源。以免疫组织化学检验抗白念珠菌IgY抗体与白念珠菌结合的特异性。ELISA测定抗白念珠菌IgY抗体的抗菌效价。结果:IgY抗体液中蛋白浓度为7.9 g/L,IgY抗体的纯度达到91.5%。提取的IgY抗体与鸡血清和正常鸡IgY抗体具有同源性。提取的IgY抗体可与白念珠菌发生特异性结合。ELISA测定抗白念珠菌IgY抗体的效价达到1∶12 000。结论:研究得到的IgY,产量和纯度高,效价好,体温条件下48 h效价没有降低。在体外能够特异性地与白念珠菌结合。

1B5单抗抑制白念珠菌对上皮细胞、内皮细胞的粘附

目的 探讨抗白念珠菌保护性单抗 1B5的保护机制。方法 分离人颊粘膜上皮细胞并对胎儿脐静脉内皮细胞进行原代培养 ,在此基础上对白念珠菌进行粘附抑制实验。结果 1B5单抗能显著减少人口腔颊粘膜上皮细胞和胎儿脐静脉内皮细胞表面粘附的白念珠菌孢子数目 ,这种抑制作用与 1B5单抗浓度成正比关系。结论 我们认为 1B5单抗抗白念珠菌感染的保护性作用机制是抗体抑制白念珠菌对粘膜上皮、血管内皮细胞的粘附 。

白念珠菌烯醇化酶1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建白念珠菌烯醇化酶1(eno1)基因的原核表达质粒并诱导其表达,制备其多克隆抗体。方法聚合酶链反应(PCR)获取白念珠菌SC5314的eno1全长基因,克隆入原核表达载体p ET30(a),转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后以亲和层析纯化重组蛋白并以SDS-PAGE和蛋白免疫印迹(Western blot)法鉴定。用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备Eno多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价,Western blot法鉴定其特异性。结果成功构建原核表达质粒p ET30(a)-eno1,诱导后表达的重组蛋白相对分子质量约为50 000,主要以可溶性上清形式存在。纯化制备的eno1多克隆抗体效价约为1︰12 800 000,可与重组Eno反应。结论成功获得白念珠菌eno1重组蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体。

抗白念珠菌感染特异性免疫实验研究

目的 了解细胞免疫和体液免疫在机体抗白念珠菌感染中的作用。方法 分别观察过继免疫T淋巴细胞、抗体和吞噬细胞的免疫功能低下小鼠抵抗腹腔白念珠菌感染情况。结果 过继上述 3种免疫成分的小鼠的腹腔、脾脏和肾脏的白念珠菌菌落数均少于没有过继免疫的小鼠 (P <0 .0 5 ) ;过继免疫T淋巴细胞组的小鼠腹腔菌落数少于免疫抗体小鼠 (P <0 .0 5 ) ;过继免疫抗体 +吞噬细胞组的小鼠肾脏白念珠菌菌落数明显少于单纯过继免疫吞噬细胞组的小鼠 ,差异有显著性 (P =0 .0 3 7)。结论 细胞免疫、体液免疫都参与机体抗白念珠菌免疫反应 ;在抗白念珠菌局部感染中细胞免疫占主导地位 ;体液免疫参与阻止白念珠菌血液播散。

直接免疫荧光法检测白色念珠菌

目的探讨多克隆抗体直接免疫荧光法检测白色念珠菌的最佳反应条件及临床应用意义。方法观察不同抗体稀释度(1:10～1:2 560),不同孵育时间(15、30、45、60、90、120 min),不同封闭剂(1％、10％牛血清白蛋白及10％小牛血清)和不同菌数对实验效果的影响。结果以抗体稀释度1:40、37℃孵育45 min、封闭剂1％或10％牛血清白蛋白以及菌数1．0×106个／ml和5．0×106个／ml为最佳反应条件。结论直接免疫荧光法检测白色念珠菌具有一定的优点和临床应用价值。

抗白念珠菌芽管单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的制备抗白念珠菌芽管的单克隆抗体mAb03.2C1-C2,并对其特性进行分析,以探讨其应用于实验室检测的可行性。方法利用杂交瘤技术制备分泌抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原mAb的杂交瘤细胞株,对mAb的Ig亚类进行鉴定。用间接免疫荧光(IIF)法对mAb的抗体活性及特异性进行测定。在白念珠菌芽管形成条件下,加入mAb,观察其对白念珠菌芽管诱导的抑制及白念珠菌对上皮细胞、内皮细胞黏附的抑制。复苏冻存的杂交瘤细胞株,分析其持续分泌mAb的能力。结果获得1株mAb03.2C1-C2,其Ig亚类为IgG1。该mAb仅与白念珠菌芽管特异性结合,并能显著降低白念珠菌芽管的生成率以及在芽管形成条件下对上皮细胞、内皮细胞的黏附,其抑制作用与该mAb的浓度呈正比。结论制备的mAb03.2C1-C2抗体效价高,在体外能抑制白念珠菌芽管的形成,降低白念珠菌的侵袭力。而且其对白念珠菌芽管具有高度的特异性,可用于白念珠菌和都柏林念珠菌的快速鉴别。

用免疫磁珠法检测抗白念珠菌烯醇化酶抗体

目的建立检测人血清抗白念珠菌烯醇化酶(Eno)IgG类抗体的免疫磁珠法,并评估其在念珠菌血症诊断中的价值。方法将Eno重组蛋白耦联至磁性微珠上,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG为二抗,优化免疫磁珠法的反应条件,考察其精密度和特异性。收集经血培养确诊的念珠菌血症患者(n=113)、念珠菌定植者(n=50)、细菌菌血症患者(n=30)和健康人对照者(n=100)血清,用免疫磁珠法测定抗Eno抗体,并与ELISA法结果进行比较。结果免疫磁珠法测定抗Eno抗体的批内、批间变异系数(CV)分别为8.2%和14.2%,重组Eno抗原对相应抗体的阻断率为91.6%。以吸光度(A)值0.29为cut off值时,诊断念珠菌血症的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为80.5%、92.3%、90.1%和84.5%。免疫磁珠法的敏感性和特异性与ELISA法比较无统计学差异,但检测流程从37℃2.5 h缩短至常温1 h。结论免疫磁珠法检测抗Eno IgG类抗体简便、快捷、可靠,在侵袭性念珠菌感染研究中具有潜在的应用价值。

抗白念珠菌单抗的保护性研究

目的 证实抗白念珠菌保护性抗体存在 ,为保护机制以及保护性工程抗体的研究打下基础。方法 在实验动物模型中观察单抗影响白念珠菌感染动物存活时间、感染动物重要脏器的组织病理变化、相应组织中白念珠菌cfu等。结果 1B5、3E8这 2株单抗能显著延长致死量白念珠菌感染小鼠存活时间 ,减少感染小鼠主要脏器组织中白念珠菌cfu ,减轻相应组织的病理损害。结论 1B5和

抗白念珠菌芽管单抗MAb03.2C1-C2特异性及临床初步应用研究

目的分析抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体MAb03.2C1-C2的特异性及其应用于实验室检测的可行性。方法用临床分离白念珠菌、致病非白念的念珠菌的孢子、菌丝及常见的酵母菌、细菌做抗原包被,用间接免疫荧光(IIF)方法,对单抗特异性进行分析。取临床口腔念珠菌病患者的真菌涂片菌丝阳性的标本,用IIF方法检测。结果MAb03.2C1-C2仅与白念珠菌芽管或菌丝特异性地结合,与白念珠菌的孢子不发生结合。13种非白念的念珠菌孢子和菌丝、新型隐球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌均不能与该单抗相结合。59例口腔念珠菌病真菌涂片IIF试验阳性的标本最终鉴定为白念珠菌(100%)。结论MAb03.2C1-C2对白念珠菌芽管有高度的特异性,并可用于口腔念珠菌病真菌涂片中白念珠菌的早期诊断。

IgY防治SPF小鼠白色念珠菌感染的研究

目的 :观察自制的抗白色念珠菌鸡蛋黄抗体IgY体内生物学效应。方法 :建立SPF小鼠烧伤后口服白色念珠菌(白念菌 )感染模型 ,应用活菌计数方法检测其回肠膜粘附白念菌量、盲肠内容物白念菌量 ,应用ELISA检测血浆肿瘤坏死因子 (TNFα)和二胺氧化酶 (DAO)含量。结果 :烧伤SPF小鼠喂服IgY后 ,能明显抑制肠道内白念菌生长和白念菌粘附肠上皮细胞 ;明显降低小鼠血浆中DAO和TNFα含量。结论

白念珠菌感染特异性Csa2蛋白双抗体夹心ELISA体系的建立与评价

目的以白念珠菌Csa2蛋白为靶标,建立双抗体夹心ELISA检测体系,评价该方法的检测灵敏度和特异性。方法构建pPIC9K-Csa2重组表达载体,电转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达、纯化重组蛋白rCsa2。rCsa2蛋白分别免疫新西兰大白兔和豚鼠制备免疫血清。以纯化兔多抗和豚鼠抗血清配对,利用棋盘滴定法,确定最佳实验条件,建立双抗体夹心ELISA检测系统。检测rCsa2和白念珠菌不同培养时间的上清,确定检测方法的灵敏度;检测其他3种念珠菌、5种曲霉、新型隐球菌和马尔尼菲青霉的培养上清,评价检测方法的特异性。结果成功构建表达载体并获得真核表达重组蛋白rCsa2,经SDS-PAGE鉴定相对分子质量(Mr)为13 300,符合预期值;Western blot法证实该蛋白可与特异性抗体结合。免疫动物获得高效价免疫血清,并以此成功建立双抗体夹心ELISA,可检测rCsa2蛋白的灵敏度约为240 pg/mL,并最早可检测到培养18 h的白念珠菌培养上清,与其他10种临床常见真菌的培养上清无交叉反应。结论建立了有较高的检测灵敏度和特异性的Csa2的双抗体夹心ELISA,为区别诊断白念珠菌感染提供新的方法。

白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定抗白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法:提取白念珠菌标准株ATCC-9002胞内烯醇化酶做抗原,再用细胞融合技术制备单克隆抗体,采用间接ELISA法对单克隆抗体进行筛选和鉴定。结果:建立了1株持续分泌抗白念珠菌烯醇化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中Mab07.4G6-F3-C7小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1:12800,单克隆抗体的重链属lgGl亚类,轻链属κ型;Western blot证实单抗能与白念珠菌烯醇化酶抗原特异性地结合。结论:本研究建立了抗白念珠菌烯醇化酶杂交瘤细胞株单克隆抗体,为快速诊断白念珠菌感染奠定了实验基础。

白念珠菌与LDH抗体的交叉免疫研究

目的识别白念珠菌苹果酸脱氢酶(Candida albicans malate dehydrogenase,CaMDH)保守表位结构。方法本研究利用生物信息学方法,预测CaMDH的结构、功能和进化关系,并选取同源序列中与CaMDH序列一致性较低的日本血吸虫乳酸脱氢酶(Schistosoma japonicum lactate dehydrogenase,SjLDH)免疫血清与白念珠菌总蛋白进行交叉免疫反应。结果发现CaMDH与常见病原生物的同源序列一致性可达43%,其中与SjLDH一致性最低(18.2%)。CaMDH具有乳酸脱氢酶保守区域,7个主要的B细胞表位,其中3处与SjLDH表位相似。苹果酸脱氢酶活化点包含于NAD(P)结合部分中。白念珠菌总蛋白与SjLDH免疫血清交叉免疫反应阳性。结论交叉免疫反应阳性提示识别结合位点为LDH/MDH同源序列高度保守的表位结构,为进一步从高度保守的抗原决定簇中筛选真菌疫苗表位、诊断特异抗体、抗真菌药物治疗靶点提供了实验基础。

寻常型银屑病患者血清中抗真菌抗原IgG,IgA,IgM水平初探

目的 :检测寻常型银屑病 (PV)患者血清中糠秕马拉色菌和白色念珠菌抗原特异性抗体水平 ,探讨两种真菌与寻常型银屑病发病的关系。方法 :间接ELISA法测定PV患者和健康对照组血清中抗糠秕马拉色菌整菌抗原 (马Wag)和可溶性抗原 (马Sag)及白色念珠菌整菌抗原 (白Wag)和可溶性抗原 (白Sag)IgG ,IgA ,IgM水平。结果 :PV患者抗马WagIgG水平较健康对照组明显增高 (P <0 .0 1) ;抗白WagIgG水平亦较健康对照组明显增高 (P<0 .0 5 )。PV患者抗马SagIgM ,抗白WagIgM ,抗白SagIgA水平明显低于健康对照组 (P <0 .0 5 )。结论 :PV患者存在体液免疫异常 ;糠秕马拉色菌和白色念珠菌可能与寻常型银屑病发病有关。

抗鸡念珠菌卵黄抗体的研制及应用

本试验以龙岩某肉鸡场发病鸡嗉囔中分离得到的念珠菌作为免疫抗原,免疫25周龄产蛋鸡.经效力检验合格后,试制成抗鸡念珠菌卵黄抗体液.抑菌活性试验表明:效价为5 log2以上的高免卵黄表现出明显的抑菌活性,完全抑制了念珠菌的生长和繁殖.用抗鸡念珠菌卵黄抗体液分别喂服20日龄肉鸡和100日龄孔雀.结果表明:试验组鸡群嗉囔和咽喉念珠菌检出率较对照组显著降低(P<0.05);平均日采食量和日增重较对照组分别提高了80%和400%,死亡率则下降了7%.对孔雀的治疗效果与常规药物CuSO4相当.