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Candida amazonensis FLP/FRT基因敲除系统的构建及初步验证
1
作者
高芝
张梁
+3 位作者
李由然
顾正华
丁重阳
石贵阳
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第12期1839-1852,共14页
【目的】构建一个适用于Candida amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并通过敲除C.amazonensis的丙酮酸脱羧酶基因(Pyruvate decarboxylase,PDC)对该系统进行初步验证。【方法】以gfpm(绿色荧光蛋白基因)为报告基因,...
【目的】构建一个适用于Candida amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并通过敲除C.amazonensis的丙酮酸脱羧酶基因(Pyruvate decarboxylase,PDC)对该系统进行初步验证。【方法】以gfpm(绿色荧光蛋白基因)为报告基因,通过添加相应诱导剂评估Spathaspora passalidarum来源启动子(SpXYLp、SpMAL6p、SpMAL1p、SpGAL1p)和Saccharomyces cerevisiae来源Sc GAL1p启动子在C.amazonensis中的诱导调控性能。选择严格诱导型启动子调控FLP重组酶的表达,并在FLP表达盒和潮霉素(Hygromycin B)抗性标记基因(hphm)两端添加同向重复的FRT位点,以PDC基因作为靶基因构建敲除盒PRFg HRP,转化宿主菌C.amazonensis CBS 12363,筛选得到阳性转化子后,通过添加诱导剂,表达FLP重组酶,实现FRT位点间片段切除。【结果】诱导调控实验表明启动子SpGAL1p(受半乳糖诱导)和SpMAL1p(受麦芽糖诱导)是适用于C.amazonensis的严格诱导型启动子。以SpGAL1p调控FLP基因表达,构建的敲除盒PRFg HRP成功转化宿主菌,获得阳性转化子C.amazonensis PDC01,通过添加半乳糖诱导,成功切除基因组中FLP表达盒和抗性标记盒,获得突变株C.amazonensis PDC02。【结论】首次建立了一个适用于C.amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并利用该系统成功敲除了C.amazonensis内的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造C.amazonensis酵母奠定了良好基础。
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关键词
candida
amazonensis
flp/
frt
诱导型启动子
基因敲除
原文传递
题名
Candida amazonensis FLP/FRT基因敲除系统的构建及初步验证
1
作者
高芝
张梁
李由然
顾正华
丁重阳
石贵阳
机构
江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室工业生物技术教育部重点实验室
出处
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第12期1839-1852,共14页
基金
国家星火计划重点项目(2015GA690004)
江苏省杰出青年基金(BK20140002)~~
文摘
【目的】构建一个适用于Candida amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并通过敲除C.amazonensis的丙酮酸脱羧酶基因(Pyruvate decarboxylase,PDC)对该系统进行初步验证。【方法】以gfpm(绿色荧光蛋白基因)为报告基因,通过添加相应诱导剂评估Spathaspora passalidarum来源启动子(SpXYLp、SpMAL6p、SpMAL1p、SpGAL1p)和Saccharomyces cerevisiae来源Sc GAL1p启动子在C.amazonensis中的诱导调控性能。选择严格诱导型启动子调控FLP重组酶的表达,并在FLP表达盒和潮霉素(Hygromycin B)抗性标记基因(hphm)两端添加同向重复的FRT位点,以PDC基因作为靶基因构建敲除盒PRFg HRP,转化宿主菌C.amazonensis CBS 12363,筛选得到阳性转化子后,通过添加诱导剂,表达FLP重组酶,实现FRT位点间片段切除。【结果】诱导调控实验表明启动子SpGAL1p(受半乳糖诱导)和SpMAL1p(受麦芽糖诱导)是适用于C.amazonensis的严格诱导型启动子。以SpGAL1p调控FLP基因表达,构建的敲除盒PRFg HRP成功转化宿主菌,获得阳性转化子C.amazonensis PDC01,通过添加半乳糖诱导,成功切除基因组中FLP表达盒和抗性标记盒,获得突变株C.amazonensis PDC02。【结论】首次建立了一个适用于C.amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并利用该系统成功敲除了C.amazonensis内的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造C.amazonensis酵母奠定了良好基础。
关键词
candida
amazonensis
flp/
frt
诱导型启动子
基因敲除
Keywords
candida amazonensis
,
flp/frt
,
inducible promoters
,
gene disruption
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
Candida amazonensis FLP/FRT基因敲除系统的构建及初步验证
高芝
张梁
李由然
顾正华
丁重阳
石贵阳
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2017
0
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