Ⅱ型犬腺病毒C株E1、E3区克隆测序及E3区标记载体瞬时表达

设计4对引物,对犬Ⅱ型腺病毒2C(CAV-2C)株E1、E3区进行了扩增,将片段进行T克隆、测序,并构建了E3区缺失、标记EGFP的转移载体,在MDCK和293-T细胞上成功表达,但在MDCK细胞中的转染效率较低。本研究为犬腺病毒活病毒载体构建的研究提供基础。

人TβRⅡ-IgG1Fc融合基因重组腺病毒载体的构建

目的构建含有人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段融合基因的腺病毒载体,并进行初步的功能活性鉴定。方法RT-PCR扩增人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段基因,通过OverlapPCR融合为目的基因hTβRⅡ-IgG1Fc;克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌,同源重组构建腺病毒质粒;将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,并扩增、纯化、RT-PCR鉴定;ELISA初步检测重组腺病毒的功能活性。结果目的基因经酶切分析、测序鉴定正确;RT-PCR及ELISA表明重组腺病毒能表达hTβRⅡ-IgG1Fc,中和HLF分泌的TGF-β1。结论成功构建了含融合基因hTβRⅡ-IgG1Fc的腺病毒载体,体外实验证实表达的蛋白具有中和TGF-β1的作用,为进一步研究放射性肺纤维化的基因治疗提供实验依据。

血管组织工程种子细胞的建立及意义

目的:利用人Nanog基因转染血管组织工程的种子细胞(血管内皮细胞ECV304),提高其增殖能力,以在较短时间内获得大量种子细胞,从而为克服血管组织工程种子细胞来源的匮乏及组织工程血管的快速构建提供新途径。方法:制备含有人Nanog基因的复制缺陷型重组腺相关病毒血清2型病毒颗粒rAAV2-hNanog,用rAAV2-hNanog转染ECV304细胞,然后采用RT-PCR检测hNanog基因在转染的ECV304细胞中的表达,再用MTT、免疫荧光及激光共聚焦技术检测hNanog基因对血管内皮细胞ECV304生长的影响。结果:(1)rAAV2-hNanog转染ECV304细胞后,RT-PCR检测表明hNanog基因能在血管内皮细胞ECV304中稳定表达;同时,血管内皮细胞在转染后的增殖能力也显著增强(P<0.05)。光镜下观察发现,转染的血管内皮细胞的形态无明显改变。结论:转染hNanog基因后,血管内皮细胞的形态无显著变化,但其增殖能力明显增强。利用hNanog基因提高血管内皮细胞的增殖能力,能够克服血管组织工程种子细胞来源不足的瓶颈,为组织工程血管的快速构建及应用提供一种新的方法。

γ干扰素转基因表达对博莱霉素致小鼠肺纤维化的作用

目的 探讨小鼠γ干扰素 (mIFN γ)在肺内局部转基因表达对博莱霉素致小鼠肺纤维化的作用。方法 6～ 8周龄雄性ICR小鼠 ,模型组第 0天经鼻滴入BLM 3mg/kg建立肺间质纤维化模型 ,预防治疗组于滴入BLM前 4 8h经鼻给予重组复制缺陷型mIFN γ腺病毒 (AdCMVmIFN γ) 5×10 8空斑形成单位 (pfu) /鼠 ,治疗组于滴入BLM后 72h经鼻给予等量AdCMVmIFN γ ,同时设立无外源活性基因的复制缺陷型腺病毒 (AdCMVNull)对照组和生理盐水阴性对照组。第 0、7、14天分别测小鼠体重 ,第 14天收获其支气管肺泡灌洗液 (BALF)和肺组织 ,右肺行苏木精 伊红 (HE)和Masson三色染色 ,左肺经酸解法检测肺组织羟脯氨酸 (HYP)含量。用酶联免疫吸附法 (ELISA)检测BALF中mIFN γ的浓度。结果 AdCMVmIFN γ转基因预防治疗组和治疗组BALF中mIFN γ含量明显增高[(2 12 5 0± 6 4 97)pg/ml,(2 10 0 0± 5 4 5 1)pg/ml],其它组BALF中mIFN γ浓度为接近零水平。上述两组与其余各组比较 ,小鼠体重明显减轻 (P <0 .0 5 ) ,肺泡炎、纤维化程度均有加重倾向 (P =0 .0 7) ,肺HYP含量增高 (P <0 .0 5 )。结论 (1)AdCMVmIFN γ经鼻滴入可在小鼠肺内实现mIFN γ转基因表达 ;(2 )在BLM模型中 ,早期mIFN γ转基因表达可在某种程度上加重BLM诱导的肺?

生物人工肾小管上皮种子细胞的建立

目的利用人Nanog基因转染生物人工肾的种子细胞（肾近曲小管上皮细胞HKC），提高其增殖能力，在较短时间内获得大量种子细胞，为克服肾脏组织工程种子细胞来源的匮乏及生物人工肾的快速构建提供新途径。方法制备含有人Nanog基因的复制缺陷型重组腺相关病毒血清2型病毒颗粒rAAV2-hNanog，用rAAV2-hNanog转染肾小管上皮细胞，然后采用RT-PCR检测hNanog基因在转染的肾小管上皮细胞中的表达，再用MTT、免疫荧光及激光共聚焦技术检测hNanog基因对肾小管细胞HKC生长的影响。结果rAAV2-hNanog转染肾小管上皮细胞后，RT-PCR检测表明hNanog基因能在肾小管上皮细胞中稳定表达；同时，小管上皮细胞在转染后的增殖能力也显著增强（P〈0．05）。光镜下观察发现，转染的小管上皮细胞的形态无明显改变。结论利用hNanog基因提高生物人工肾小管种子细胞的增殖能力，可为生物人工肾的快速构建及应用提供一种新的方法。