用E.coli表达Canstatin-N及其表达条件优化

以重组质粒pET-CN为模板设计引物CASN1和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoR I和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b(+)载体获得重组表达质粒pET-22b(+)-CN,转化E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0.1mmol/L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合his6的重组Canstatin-N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管生成活性。

Canstatin-N基因在Pichia pastoris中表达及产物活性分析

目的:应用P.pastoris的pAOX1表达系统胞内表达canstatin-N蛋白。方法:通过PCR DNA合成技术以及DNA的酶切和连接技术,除去pPIC9K分泌型表达载体的信号肽,并使其载体的多克隆位点的3′端融合his6纯化标签,获得新的载体pPIC9Ki。以含canstatin N端序列的pET-CTN质粒为模版,PCR法扩增1～89个氨基酸的267bp的canstatin的N端基因片段,将其连接于pPIC9Ki的多克隆位点,获得重组表达质粒pPIC9Ki-CTN-N,用电转法将pPIC9Ki-CTN-N转化P.pastorisGS115,通过G418抗性筛选获得工程菌GS115(pPIC9Ki-CTN-N)。通过摇瓶发酵甲醇诱导表达Canstatin-N蛋白。用蜗牛酶裂解P.pastoris细胞,SDS-PAGE分析蛋白表达情况,在鸡胚中进行活性分析。结果:在pAOX1的调控下,canstatin-N基因能在P.pastoris中经甲醇诱导表达,摇瓶发酵表达量为65mg/L,纯化的目的蛋白具有显著的抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用。结论:实现应用P.pastoris表达Canstatin-N蛋白,为Canstatin-N蛋白的规模化生产和进一步的药用研究奠定了基础。

用毕赤酵母组成型分泌表达Canstatin-N

目的:用毕赤酵母的GAP启动子调控组成型表达Canstatin-N。方法:将canstatin-N基因重组于毕赤酵母表达载体pGAP9K的多克隆位点获得pGAP9K-can-N。用电转法将pGAP9K-can-N转化毕赤酵母GS115。筛选高G418抗性的克隆作为工程菌GS115(pGAP9K-can-N)。发酵GS115(pGAP9K-can-N)分泌表达Canstatin-N,用离子交换法纯化目标蛋白。结果:以葡萄糖为碳源,发酵48h分泌表达人血管能抑素蛋白56 mg/L。结论:用毕赤酵母的GAP启动子调控组成型表达的人血管能抑素蛋白具有诱发血管内皮细胞凋亡的生物活性。

人血管能抑素免疫兔抗血清制备及其特性测定

纯化的人血管能抑素包涵体进行SDS＿PAGE分离,切胶回收目的蛋白,与弗氏不完全佐剂充分乳化后,进行多点皮下注射免疫新西兰白兔,制备兔抗人血管能抑素抗血清,抗血清去除交叉反应抗体后,进行WesternBlotting分析抗血清与人血管能抑素及其N端和C端片段的抗原抗体反应特性。结果表明,经过4次加强免疫后,获得了高效价的兔抗人血管能抑素抗血清。抗血清去除交叉反应抗体后,WesternBlotting分析表明,它能与人血管能抑素发生特异的抗原抗体反应,同时还能与人血管能抑素的N端片段和C端片段发生特异性较弱的抗原抗体反应。证明制备的兔抗人血管能抑素抗血清能应用于人血管能抑素及其N端和C端片段免疫学研究中。