鸽圆环病毒Cap基因SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种针对鸽圆环病毒(PiCV)的快速诊断方法,试验根据PiCV的Cap保守基因序列,设计合成一对特异性引物,建立了PiCV荧光定量PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明:在最佳反应条件下,所建立的PiCV荧光定量PCR方法在1×10^(2)~1×10^(7) copies/μL标准品范围内具有良好的线性相关性,线性相关系数为0.9846;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到1×10^(2) copies/μL标准品,是常规PCR检测方法的100倍;特异性试验结果显示,该方法与其他常见的鸽病病原不发生交叉反应;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于2%;所建立PiCV荧光定量PCR方法对临床病死鸽肝脏样品检测结果显示,PiCV阳性率达75.7%,高于常规PCR方法的检测阳性率(54.1%),说明该方法具有良好的适用性。可应用于对PiCV的快速检测,为PiCV的及时防控提供有力技术支持。

鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

Mapping of putative sucking inhibitory gene to whitebacked planthopper by linkage analysis with CAPS markers

Resistance to whitebacked planthopper(WBPH)in Chinese japonica riceChunjiang 06(CJ-06)was mediated by sucking inhibitory and ovicidal mecha-nism.The ovicidal reponse was a common self-defense mechanism againstWBPH in japonica.The ovicidal gene and its chromosomal position had alreadybeen identified.The sucking inhibitory nature of CJ-06 caused a definenon-preference behavior of WBPH in fields.A single dominant gene governed

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10^(1) copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^(-2) pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。

基于基因重测序信息的大豆基因靶向CAPS标记开发

为了开发大豆基因靶向的功能分子标记,本研究采用生物信息学方法分析了大豆基因重测序数据,筛选出酶切位点突变的SNP位点,设计PCR引物163对,选用东北地区主栽品种绥农14的DNA为模板进行PCR扩增,其中139对引物获得大小为400～1200bp的特异片段。以大豆绥农14、合丰25、Acher、Evans、Peking、PI209332、固新野生大豆、科丰1号和南农1138-2的DNA为模板,采用筛选的139对引物进行PCR扩增,对扩增产物进行酶切分析,发现73对引物的PCR产物具有酶切多态性,开发出CAPS标记73个。通过功能注释分析发现,这73个CAPS标记靶向的基因主要参与细胞内亚细胞定位过程、蛋白质的结合与催化以及代谢过程等,与大豆重要农艺性状的形成相关,可以用于大豆品种的鉴定和分子系统进化的研究。

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。

鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。

猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达

Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据。本研究根据PCV2TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应。本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础。

猪细小病毒7型VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪细小病毒7型(PPV7)VP2蛋白(由Cap基因编码)并制备其多克隆抗体,试验从GenBank数据库中下载PPV7 Cap基因序列,选择不同毒株的高频序列作为目的基因序列,使用T4 DNA连接酶将目的基因与pET-32a表达载体连接,将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,并使用IPTG对重组菌进行诱导,对表达的重组蛋白进行可溶性分析与纯化并通过Western-blot检测重组蛋白的反应原性,用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并分别通过间接ELISA方法、Western-blot检测多克隆抗体的效价及其与重组蛋白的反应性。结果表明:诱导后的重组菌在56 ku处出现明显条带,重组蛋白主要以包涵体的形式表达;纯化后的重组蛋白为单一条带,质量浓度为0.46 mg/mL,能与His标签抗体特异性结合;制备的多克隆抗体的效价为1∶51200,能与重组蛋白特异性结合。说明PPV7 VP2蛋白获得了成功表达,该蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,所制备的多克隆抗体效价较高。

猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立与Cap基因序列分析

建立一种检测PCV3流行毒株感染的PCR方法,并分析Cap基因序列变异情况,为PCV3流行病学调查提供技术支持。根据GenBank中公开的PCV3全基因序列,分别设计了质粒构建引物和检测引物,通过构建阳性质粒、灵敏度试验、特异性试验、临床样品检测试验以及测序分析,建立PCR检测方法。结果显示:建立的PCR方法检测的极限为50 copies/μL,以PRRSV、CSFV、PEDV、PRV、PPV、PCV-2的cDNA/DNA作为模板,用该方法扩增结果均为阴性,表明建立的方法特异性良好;应用该方法检测了285份样品,阳性39份,阳性率为13.7%。Cap基因序列分析显示,20株比对序列核苷酸同源性为87.1%~100%,SXSL1702与SXXA1812同源性为87.1%,在基因进化树中SXSL1702单独构成一个分支,提示SXSL1702株Cap基因与其他毒株有较大差异。成功建立了检测PCV3感染的PCR方法,为进一步流行病学调查和生物学特性研究奠定了基础。

猪圆环病毒3型陕西株Cap基因的克隆、序列分析及原核表达

为了克隆猪圆环病毒3型Cap基因并进行序列分析和原核表达,参考GenBank上已发表的PCV3(KY418606.1)Cap基因序列,合成1对上、下游引物,PCR扩增Cap基因,进行序列分析和原核表达。结果显示,成功克隆到642 bp的Cap基因,核苷酸序列分析显示,PCV3 Cap基因与国内分离株核苷酸同源性最高为95.97%,氨基酸分析显示Cap蛋白不含信号肽和跨膜区。经IPTG诱导后获得了分子质量约35 ku的Cap蛋白,该蛋白能与PCV3阳性血清结合,具备良好的抗原性。成功克隆并原核表达PCV3陕西株Cap基因,为进一步建立PCV3的快速检测方法和研制PCV3亚单位疫苗奠定了基础。

2017年-2019年郑州地区猪圆环病毒3型分子流行病学调查及Cap基因序列分析

为了分析2017年-2019年郑州地区猪场中猪圆环病毒3型(PCV-3)分子流行情况及代表株Cap基因序列遗传情况,采集郑州地区规模化猪场、散养猪场中患病猪的淋巴结、脾脏、肾脏及血清样品1175份,采用PCR进行PCV3检测,并选择代表株的Cap基因进行PCR检测与分析其遗传变异情况。结果表明,2017年-2019年郑州地区猪场PCV3总阳性率为14.6%,2019年阳性率最高(19.5%),呈现逐年升高的趋势;8个代表株PCV3 Cap基因序列与GenBank登录的12株参考株的同源性在92.%~100%之间;系统进化树表明7个代表株PCV3的Cap基因序列与12株参考株位于一个大的分支,另外1株单独构成一个分支,8个代表株PCV3 Cap基因个别碱基发生变化,未出现明显的遗传变异情况。研究结果为该地区猪场中PCV3流行病学调查及综合防控提供科学依据。

猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达

用EcoR酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2+。用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证明该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白。重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定。该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8TCID50/0.1mL。

番茄叶霉病高抗基因Cf-9的CAPS标记创建

根据番茄叶霉病高抗基因Cf-9的基因序列设计3对特异扩增引物,以近等基因系和本组的多重PCR检测材料为试材,扩增Cf-9基因1～2867 bp之间的单拷贝片段,3对引物分别扩增出560 bp,1 000 bp,1 080 bp的特异片段.分别用限制性内切酶TaqⅠ,Hind Ⅲ,HinfⅠ,EcorⅠ酶切,限制性内切酶TaqⅠ酶切特异引物SCAR1扩增的560特异片段具有酶切多态性,抗病品种酶切出450 bp,330 bp,290 bp的特异片段,感病品种酶切出450 bp,290 bp的特异片段.初步建成番茄叶霉病高抗基因Cf-9的CAPS标记,经近等基因系及其杂交种检验,结果稳定可靠,可用于番茄Cf-9抗病基因辅助选育.

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4~0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

结球甘蓝BoCBF1与BoCBF2基因的CAPS标记及其对耐寒性的影响

以两份具有不同耐寒性的甘蓝自交系341和21-3为试材,根据已有拟南芥CBF1基因序列及甘蓝基因组测序拼接出的Scaffold信息,获得了甘蓝BoCBF1和BoCBF2基因编码区的全长序列。经PCR产物直接测序发现BoCBF1基因在自交系341和21-3间的变异表现为4个单核苷酸多态性(SNP),而BoCBF2基因则表现为16个SNP及1个18bp碱基的插入缺失(InDel)。为简便快捷地鉴定两个自交系间BoCBF1和BoCBF2基因序列的变异,开发了BoCBF1和BoCBF2基因的CAPS标记,分别命名为BoCBF1-TaqαⅠ和BoCBF2-BstUⅠ。利用这两个CAPS标记对两个自交系、F1、F2群体的基因型与耐寒性进行相关性分析,发现这两个基因的变异与材料的耐寒性极显著相关,可用该标记进行甘蓝耐寒育种的分子标记辅助选择。

番茄抗晚疫病基因ph-3的RAPD及CAPS标记

将番茄抗晚疫病ph-3基因已有的RAPD特异片段进行克隆、测序。根据该测序结果设计SCAR引物对抗病亲本、感病亲本、抗病池、感病池、F1个体进行扩增,均获得一条592bp的特异片段。感病基因型和杂合抗病基因型存在XbaⅠ酶切位点,酶切后分别产生了261bp、193bp和95bp以及592bp、261bp、193bp和95bp的特异性片段,纯合抗病基因型无此酶切位点,酶切结果仍为592bp的产物。这些片段能成功区分抗病材料、感病材料和F1个体,很有可能是与ph-3基因连锁的CAPS标记。

番茄黄化卷叶病毒病抗病基因Ty-1的CAPS标记建立

本研究旨在筛选获得与番茄黄化卷叶病毒抗病基因Ty-1紧密连锁的分子标记,为番茄抗病育种提供技术支撑。根据与抗病基因Ty-1紧密连锁的RFLP标记序列设计特异引物,以抗病杂合体(Ty-1/ty-1)、抗病纯合体(Ty-1/Ty-1)和感病纯合体(ty-1/ty-1)材料提取的DNA为模板,进行PCR扩增,而后经不同的核酸内切酶酶切处理,筛选获得与Ty-1基因紧密连锁的CAPS标记。结果显示从4个标记中筛选获得了2个稳定可靠的CAPS标记,即TG97和Mi23。TG97标记在抗病杂合体产生398bp、303bp和95bp3个特异片段,抗病纯合体产生303bp和95bp2个特异片段,感病纯合体产生398bp1个特异片段。Mi23标记在抗病杂合体产生402bp和354bp2个特异片段,抗病纯合体产生402bp1个特异片段,感病纯合体产生354bp1个特异片段。研究结果表明TG97和Mi23这2个CAPS标记均为共显性标记,可用于番茄抗病育种的辅助选择中。

鸽圆环病毒Cap基因的克隆与进化分析

应用PCR方法对采集的144份血清样品进行鸽圆环病毒(Pigeon circovirus,PiCV)检测,随机选择6份阳性样品进行Cap基因的扩增、纯化,并克隆至pM D18-T载体。测序结果与已知参考毒株进行序列比对和系统进化分析。结果显示:PiCV阳性检出率为75%(108/144),说明PiCV的感染比较严重。自测的6株Cap基因核苷酸的同源性为74.0%~100.0%,与GenBank上登录的国内外14株的Cap基因的核苷酸同源性为72.1%~100.0%。通过进化树分析6株阳性样品分成两大分支:5株位于一大分支,亲缘关系较近;但HBL F株单独位于另外一大分支,与其它5株亲缘关系远。

粗穗披碱草1H^tS染色体的蛋白质二硫键异构酶基因CAPS标记

中国春-粗穗披碱草罗伯逊1Ht S.1BL易位系高抗小麦条锈病、叶锈病和白粉病。为了获得抗病小片段易位系,用中国春ph1b基因缺失突变体对1Ht S.1BL进行了诱导,获得了大量诱导后代。本研究用位于小麦1DS染色体的87个EST-STS标记对中国春、粗穗披碱草和1Ht S.1BL易位系进行分析,未发现多态性标记。对其中扩增较好的引物BE444859的PCR产物进行随机克隆测序,获得了14个序列,与已发表的小麦蛋白质二硫键异构酶基因序列具有97%以上的同源性,14个序列均包含3个外显子和2个内含子。限制性酶切位点分析表明,仅2个序列含有HaeIII酶切位点。验证实验结果表明,BE444859/HaeIII组合可以在供试材料中获得多态性。进而用BE444859/HaeIII对一套中国春-粗穗披碱草附加系和151株诱导后代材料进行分析,结果显示,特异多态性条带仅出现在含1Ht S的材料中;68株后代材料均可扩增出多态性带。因此,BE444859/HaeIII可以作为粗穗披碱草蛋白质二硫键异构酶基因CAPS标记,用于检测小麦背景中的1Ht S染色体。本研究揭示当杂交亲本间无直接PCR多态性而又需要建立标记时,发展CAPS标记是行之有效的方法。