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猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立
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作者 张宝戈 黄雅琴 +2 位作者 蔡金双 朱晨光 李玉峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1170-1178,共9页
旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆... 旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 cap重组蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA
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猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达与鉴定
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作者 朱钰英 高翠翠 +6 位作者 唐青海 刘婷 赵婷芳 曾沛暄 赵铖 胡意 李小申 《湖南畜牧兽医》 2024年第2期35-38,共4页
[目的]研究旨在扩增PCV3病毒的Cap基因,体外表达PCV3 Cap蛋白。[方法]试验分别建立重组原核表达载体p ET28a-PCV3-Cap和p Cold-PCV3-Cap,转化Rosetta(DE3)表达菌株,在不同温度条件下诱导表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋... [目的]研究旨在扩增PCV3病毒的Cap基因,体外表达PCV3 Cap蛋白。[方法]试验分别建立重组原核表达载体p ET28a-PCV3-Cap和p Cold-PCV3-Cap,转化Rosetta(DE3)表达菌株,在不同温度条件下诱导表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白鉴定。[结果]PCV3 Cap蛋白在p ET28a原核表达系统中无表达;Rosetta-p Cold-PCV3-Cap在诱导温度为15℃、IPTG浓度为1.0 mmo L/L、诱导4 h的条件下,能够表达分子量约为25 k Da的Cap蛋白,且为可溶性表达。[结论]试验成功制备了PCV3 Cap蛋白,为制备PCV3疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型(PCV3) cap蛋白 原核表达 鉴定
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猪圆环病毒2型山西流行株Cap蛋白可溶性表达与免疫原性分析
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作者 薛翼鹏 赵岳 +4 位作者 程景 孟帆 樊振华 米瑞娟 吴忻 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第1期28-35,共8页
为建立猪圆环病毒2型(PCV2)山西流行毒株Cap蛋白的原核可溶性表达体系,并分析比较重组蛋白与2种商品化基因工程Cap亚单位疫苗在小鼠体内不同阶段的免疫原性,本试验以PCV2e SXJX株(GenBank登录号:MH922991.1)的ORF 2基因为基础,根据大肠... 为建立猪圆环病毒2型(PCV2)山西流行毒株Cap蛋白的原核可溶性表达体系,并分析比较重组蛋白与2种商品化基因工程Cap亚单位疫苗在小鼠体内不同阶段的免疫原性,本试验以PCV2e SXJX株(GenBank登录号:MH922991.1)的ORF 2基因为基础,根据大肠埃希菌密码子偏性优化序列,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)中,鉴定为阳性后转入宿主菌BL21(DE3)中,经优化表达条件后,对超声破碎后的菌体上清进行纯化,分析纯化后产物的纯度和抗原性,并利用负染透射电镜观察重组Cap蛋白体外自组装成病毒样颗粒(VLPs)。分别将同等免疫剂量的PCV2e重组Cap蛋白和2种商品化PCV2基因工程亚单位疫苗免疫健康BALB/c雌鼠,应用ELISA方法检测不同阶段小鼠体内特异性抗体的水平。结果显示:重组Cap蛋白可在大肠埃希菌中表达,以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中,表达产物纯化效果良好,并能被PCV2单克隆抗体识别;透射电镜观察结果发现,表达的重组Cap蛋白可以自组装成约20 mm大小的VLPs;动物免疫试验结果显示,在首免后第21天PCV2e Cap试验组抗体水平显著高于勃林格疫苗组(P<0.05),但极显著低于普莱柯疫苗组(P<0.01),首免后第42天3个免疫组的抗体水平差异不显著(P>0.05),表明重组蛋白在小鼠体内免疫原性良好。本试验成功构建了PCV2e Cap蛋白原核可溶性表达体系,其重组蛋白具有较好的免疫原性,为PCV2的诊断检测和亚单位基因工程疫苗的研制提供了候选抗原,并为该蛋白功能的深入研究提供了科学依据。 展开更多
关键词 PCV2 cap蛋白 可溶性表达 免疫原性
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PCV3吉林野毒株全基因组序列分析及其Cap蛋白的亚细胞定位
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作者 刘东旭 刘宏莹 +5 位作者 苏诺 葛桂阳 麻宝艺 盛陈艳 李东丽 刘艺 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第4期27-32,共6页
为了研究吉林省猪圆环病毒3型(PCV3)野毒株遗传变异情况及其衣壳蛋白(Cap)的亚细胞定位特征,本试验对收集到的10株PCV3吉林野毒株进行全基因组序列测定和分析,并构建真核表达载体pcDNA3.1V5/HisA-Cap转染猪肺巨噬细胞(PAM);继而用本实... 为了研究吉林省猪圆环病毒3型(PCV3)野毒株遗传变异情况及其衣壳蛋白(Cap)的亚细胞定位特征,本试验对收集到的10株PCV3吉林野毒株进行全基因组序列测定和分析,并构建真核表达载体pcDNA3.1V5/HisA-Cap转染猪肺巨噬细胞(PAM);继而用本实验室已构建的兔源PCV3-Cap多克隆抗体,通过激光共聚焦检测Cap蛋白在PAM中的定位。序列分析结果显示,10株PCV3吉林野毒株与国内外参考株之间的全基因组核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,处于PCV3a和PCV3b两个亚群;基因重组分析结果显示,仅中国参考株MF589102(2016年)、MH445396(2019年)和分离株JL-2在80~303 nt、840~1196 nt和1885~2001 nt处发生3处重组。激光共聚焦检测结果显示,Cap蛋白大部分定位于细胞核,少部分定位于细胞质。结果表明,目前吉林省PCV3比较保守,没有出现较大变异,Cap蛋白在PAM的细胞核和细胞质中均有分布。 展开更多
关键词 野毒株 猪圆环病毒3型 cap蛋白 亚细胞定位
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猪圆环病毒2型全基因组序列分析及Cap蛋白CTL表位预测 被引量:2
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作者 周文锋 张英婕 +6 位作者 白一涵 张露华 麦金辉 王乃东 杨毅 湛洋 王东亮 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期656-665,共10页
【目的】监测当前湖南省猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株及其衣壳蛋白(capsid protein,Cap)变异情况,并预测Cap蛋白细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位,为新型PCV2疫苗研制和病毒净化提供参考... 【目的】监测当前湖南省猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株及其衣壳蛋白(capsid protein,Cap)变异情况,并预测Cap蛋白细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位,为新型PCV2疫苗研制和病毒净化提供参考依据。【方法】本研究对2019-2021年于湖南省6个地区收集的17份PCV2阳性组织样品进行PCV2全基因组序列扩增及测序分析,绘制系统进化树,利用生物信息学方法分析Cap蛋白氨基酸变异情况,并预测CTL表位。【结果】系统进化树显示,获得的17株PCV2全基因组序列中,1株PCV2a、7株PCV2b和9株PCV2d。Cap蛋白氨基酸序列比对分析发现,共有16个氨基酸残基突变位点位于病毒Cap蛋白表面,且有11个突变位点参与构象型表位的形成。此外,共预测出9个PCV2 Cap蛋白潜在的CTL表位,其中4个表位(16-24、28-36、136-144和179-187位氨基酸)在GenBank的1610株PCV2不同基因型毒株中高度保守。通过TCR-pMHC复合物3D结构对4个保守性表位进一步分析,结果显示,这4个肽段均能与MHCⅠ分子和TCR形成稳定的TCR-pMHC复合物。【结论】本研究结果表明,PCV2b和PCV2d为当前湖南省主要流行的基因型,且表现出高度变异;预测的CTL表位可作为候选抗原表位。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(PCV2) cap蛋白 CTL表位
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猪圆环病毒3型Cap重组鞭毛蛋白融合表达及其免疫原性研究
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作者 姜海军 王丹 +5 位作者 郭禹 韦莉 侯磊 王菁 朱珊珊 刘爵 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期2044-2052,共9页
【目的】利用重组杆状病毒系统表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)Cap重组鞭毛蛋白并研究该蛋白的反应原性和免疫原性,为开发PCV3亚单位疫苗提供数据支持。【方法】通过对Cap基因进行最适密码子优化并与鼠伤寒沙门氏菌... 【目的】利用重组杆状病毒系统表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)Cap重组鞭毛蛋白并研究该蛋白的反应原性和免疫原性,为开发PCV3亚单位疫苗提供数据支持。【方法】通过对Cap基因进行最适密码子优化并与鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因Flagellin进行融合后克隆到pFastBac TMⅠ载体。通过Bac-to-Bac系统,筛选获得重组Cap-Flagellin杆状病毒,利用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blotting鉴定重组杆状病毒,将重组Cap-Flagellin杆状病毒免疫小鼠评价其免疫原性。【结果】重组Cap-Flagellin杆状病毒在Sf9细胞中能有效表达重组蛋白,SDS-PAGE检测可见68 ku的目的条带。IFA结果显示,重组Cap-Flagellin杆状病毒感染后72 h在Sf9细胞膜及胞浆中均出现绿色特异性荧光;Western blotting分析表明,重组蛋白能与PCV3阳性血清发生特异性反应,表明重组Cap-Flagellin蛋白具有良好的反应原性。小鼠免疫试验结果表明,与Cap杆状病毒组相比,重组Cap-Flagellin杆状病毒免疫小鼠2l和28 d后可诱导产生更高水平的Cap特异性抗体(P<0.05;P<0.01),且Cap-Flagellin杆状病毒组小鼠脾细胞白细胞介素-8(IL-8)细胞因子水平显著或极显著高于其他组(P<0.05;P<0.01),表明重组Cap-Flagellin蛋白具有良好的免疫原性。【结论】本研究利用杆状病毒表达系统成功表达了PCV3 Cap重组鞭毛蛋白,并证实其具有良好的生物学活性,为PCV3亚单位疫苗的开发研制奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型(PCV3) 重组杆状病毒 cap蛋白 鞭毛蛋白 免疫特性
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表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组链球菌的构建及其免疫原性分析
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作者 宗雪晴 赵贤杰 +8 位作者 胡俊冶 余肇锋 李国潮 何颍欣 黄云飞 马春全 李舜 李亚娟 付强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期611-620,共10页
猪圆环病毒2型(PCV2)常与马链球菌兽疫亚种(SEZ)混合感染。为构建表达PCV2 Cap蛋白的重组SEZ并分析其免疫原性,本研究通过PCR扩增PCV2 Cap基因和SEZ疫苗株ST171 Szp基因的上下游同源臂基因(Szp-up、Szp-down),将上述PCR产物分别与pMD19-... 猪圆环病毒2型(PCV2)常与马链球菌兽疫亚种(SEZ)混合感染。为构建表达PCV2 Cap蛋白的重组SEZ并分析其免疫原性,本研究通过PCR扩增PCV2 Cap基因和SEZ疫苗株ST171 Szp基因的上下游同源臂基因(Szp-up、Szp-down),将上述PCR产物分别与pMD19-T载体连接,分别构建重组质粒pMD19-T-Cap、pMD19-T-Szp-up和pMD19-T-Szp-down。将pMD19-T-Szp-up与pG+host5分别双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp-up;将pMD19-T-Szp-down与pG+host5-Szp-up分别经双酶切后构建重组质粒pG+host5-Szp。上述重组质粒均经酶切和测序鉴定正确后分别经BamH I酶切pG+host5-Szp载体和pMD19-T-Cap载体后构建重组载体pG+host5-PCV2-Cap-Szp,并使PCV2 Cap基因替换Szp基因的166 bp~783 bp。经酶切和测序鉴定正确后将该质粒电转化ST171感受态细胞,通过红霉素抗性板筛选重组SEZ PCV2-Cap-Szp/ST171株。通过菌落计数分别绘制PCV2-Cap-Szp/ST171及其亲本菌株ST171的生长曲线;分别采用荧光定量PCR(qPCR)检测重组菌株Cap基因以及亲本菌株ST171 Szp基因的转录水平;通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定重组菌株Cap蛋白的表达。结果显示,亲本菌株和重组菌株的生长曲线基本一致,重组菌株中Cap基因的转录水平与亲本菌株中Szp基因的转录水平相当,且其中的蛋白肽段与PCV2 Cap蛋白的肽段相符,表明插入Szp基因不影响ST171的生长特性,且重组菌中的Cap基因可以正常转录并能够表达Cap蛋白。分别经小鼠腹腔接种不同剂量的重组菌株及亲本菌株,并采用改良寇氏法(Karber氏法)计算两株菌对小鼠的半数致死量(LD50)。结果显示,重组菌株及亲本菌株对小鼠的LD50分别为3.21×108 cfu/mL及2.0×10^(7) cfu/mL,虽然前者对小鼠的LD50有所升高,但其对小鼠的致病性并未增强。将重组菌株及亲本菌株灭活乳化后与商品化的PCV2灭活疫苗分别免疫小鼠,0.5 mL/只,二免后14 d采用间接ELISA检测各组小鼠血清中的Cap蛋白抗体水平,结果显示,免疫亲本菌株及PBS对照小鼠均未产生PCV2 Cap蛋白特异性抗体,而重组菌株刺激小鼠产生的Cap蛋白抗体水平极显著高于PCV2商品化疫苗(P<0.001)。将上述3株菌按照上述方法分别经腹腔免疫小鼠。二免后14 d经腹腔以0.5 mL 1×106 cfu/mL的SEZ C55138株攻击,观察记录小鼠的死亡情况,并绘制生存曲线;将重组菌株和亲本菌株按照上述方法免疫小鼠,二免14 d后经腹腔接种0.2 mL 1×108拷贝/mL的PCV2。分别于攻毒后不同时间采血,采用qPCR检测各组小鼠血清中的病毒载量。SEZ C55138株攻毒结果显示,免疫ST171与PCV2-Cap-Szp/ST171的小鼠均未出现临床症状和死亡,存活率达100%;而两个阴性对照组小鼠攻菌后均表现出相应临床症状,并相继死亡,死亡率分别为70%和80%。PCV2攻毒实验结果显示,与免疫ST171组小鼠相比,免疫重组菌株的小鼠在攻击PCV2后1 d、3 d和5 d小鼠血清中的病毒载量均有所降低。上述结果表明,本实验构建的重组菌株PCV2-Cap-Szp/ST171能够诱导免疫小鼠产生高水平的体液免疫反应,并保护小鼠免受致病性SEZ的伤害及减少PCV2攻毒后小鼠血清中的病毒载量,本研究为细菌活载体疫苗及PCV2和SEZ二联疫苗的研发奠定基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 cap蛋白 马链球菌兽疫亚种 重组菌株
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PCV2 Cap蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备
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作者 李钰昌 郑亮 +3 位作者 张华 吴志军 肖莉杰 曹宏伟 《黑龙江八一农垦大学学报》 2023年第1期78-83,130,共7页
猪圆环病毒2型是一种常见的猪感染性病毒,Cap蛋白为猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白,也是该病毒最主要的结构蛋白,是目前猪圆环病毒2型基因工程疫苗研制的关键蛋白。研究构建了Cap蛋白原核表达质粒pET28a-His-Cap,转化Transetta(DE3)表达菌株... 猪圆环病毒2型是一种常见的猪感染性病毒,Cap蛋白为猪圆环病毒2型的核衣壳蛋白,也是该病毒最主要的结构蛋白,是目前猪圆环病毒2型基因工程疫苗研制的关键蛋白。研究构建了Cap蛋白原核表达质粒pET28a-His-Cap,转化Transetta(DE3)表达菌株,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE及蛋白免疫印迹试验验证,重组蛋白主要以可溶性形式表达,少数为包涵体蛋白。以Ni-NTA树脂进行蛋白纯化,纯化后蛋白浓度为629μg·mL^(-1),采用透析袋浓缩将重组蛋白浓缩,浓缩后蛋白终浓度为1.8 mg·mL^(-1)。将重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合,充分乳化后制备抗原,免疫兔子采集全血,分离血清。经蛋白免疫印迹试验,该多抗与重组蛋白存在免疫反应性,ELISA检测抗体效价可达1∶32000,IFA试验证明该多抗能够特异性识别猪圆环病毒2型。Cap蛋白多克隆抗体的成功制备,为后续猪圆环病毒2型基因工程疫苗制备过程中验证Cap体外蛋白表达提供了材料。 展开更多
关键词 PCV2 cap蛋白 原核表达 多克隆抗体
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Protein-losing pseudomembranous colitis with cap polyposis-like features 被引量:2
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作者 Wolfgang Kreisel Guenther Ruf +6 位作者 Richard Salm Adhara Lazaro Bertram Bengsch Anna-Maria Globig Paul Fisch Silke Lassmann Annette Schmitt-Graeff 《World Journal of Gastroenterology》 SCIE CAS 2017年第16期3003-3010,共8页
Protein-losing enteropathy(PLE) is characterized by loss of serum proteins into the gastrointestinal tract. It may lead to hypoproteinemia and clinically present as protein deficiency edema, ascites, pleural or perica... Protein-losing enteropathy(PLE) is characterized by loss of serum proteins into the gastrointestinal tract. It may lead to hypoproteinemia and clinically present as protein deficiency edema, ascites, pleural or pericardial effusion and/or malnutrition. In most cases the site of protein loss is the small intestine. Here we present an unusual case of severe PLE in a 55-year old female with a one-year history of recurrent diarrhea, crampy abdominal pain, and peripheral edema. Endoscopy and MRI showed a diffuse inflammatory thickening of the sigmoid colon and the rectum. Surgical resection of the involved colon was performed and the symptoms were significantly resolved. The final histologic evaluation confirmed a diagnosis of a pseudomembranous colitis with cap polyposis-like features. Such a cause of PLE has never been described before. 展开更多
关键词 protein-losing ENTEROPATHY cap POLYPOSIS ULCERATIVE COLITIS Goblet cells Pseudomembranes
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猪圆环病毒2a型和2b型Cap蛋白的原核表达及鉴定
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作者 赵婷芳 高翠翠 +9 位作者 唐青海 赵铖 蔡林娜 侯鑫军 刘婷 全飞杨 胡意 刘会敬 杨灿 杨海 《湖南畜牧兽医》 2023年第1期38-43,共6页
为制备猪圆环病毒2a型(PCV2a)和2b型(PCV2b)Cap蛋白,用生物信息学软件优化PCV2a Cap基因和PCV2b Cap基因密码子、克隆至pET28a载体中、转化BL21(DE3)、构建重组蛋白表达菌株,通过优化原核表达的温度、IPTG浓度等条件进行蛋白表达,采用SD... 为制备猪圆环病毒2a型(PCV2a)和2b型(PCV2b)Cap蛋白,用生物信息学软件优化PCV2a Cap基因和PCV2b Cap基因密码子、克隆至pET28a载体中、转化BL21(DE3)、构建重组蛋白表达菌株,通过优化原核表达的温度、IPTG浓度等条件进行蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果显示:重组PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白的分子量约为30 kDa,在不同温度下都以包涵体形式存在,在37℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达的Cap蛋白表达量最高。试验成功制备了PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白,为制备PCV2二价疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 cap蛋白 原核表达 诱导 包涵体
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The Mapping and Characterization of Cruella (Cru), a Novel Allele of Capping Protein α (Cpa), Identified from a Conditional Screen for Negative Regulators of Cell Growth and Cell Division
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作者 Ashley Cosenza Jacob D. Kagey 《Advances in Bioscience and Biotechnology》 2016年第10期373-380,共8页
A Flp/FRT EMS mutagenesis screen was conducted in the eye of Drosophila melanogaster on chromosome 2R to identify negative regulators of cell growth and cell division. In addition to the EMS mutation in the mosaic eye... A Flp/FRT EMS mutagenesis screen was conducted in the eye of Drosophila melanogaster on chromosome 2R to identify negative regulators of cell growth and cell division. In addition to the EMS mutation in the mosaic eye, an ark loss of function allele (ark<sup>82</sup>) was utilized to block apoptosis in the homozygous mutant cells, setting up a screen for conditional regulators of cell growth and cell division. In the present study, we focus on the characterization and mapping of one mutant that resulted from this screen, Cruella (cru). A cross between flies with the flippase enzyme directed to the developing eye and flies with the mutations cru, ark<sup>82</sup>, revealed an unusual phenotype that resulted in the homozygous mutant tissue appearing black, in contrast to the expected red. To map the location of this mutation, complementation tests against the Bloomington deficiency kit were conducted. Cru failed to complement previously characterized alleles of capping protein α (cpa). Thus, cpa<sup>cru</sup> is a novel allele of cpa and displays phenotypes similar to previously characterized alleles such as cpa 107E, cpa 69E, and cpa<sup>scrd</sup> . The human homolog, Cap Z, is conserved in humans and serves a similar role in act in filament regulation. 展开更多
关键词 capping protein α APOPTOSIS Genetic Screen Drosophila melanogaster
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Homology Modelling and Structural Comparisons of Capsid-Associated Proteins from Circoviruses Reveal Important Virus-Specific Surface Antigens 被引量:1
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作者 Edward I. Patterson Jade K. Forwood Shane R. Raidal 《Crystal Structure Theory and Applications》 2012年第2期9-16,共8页
Circoviridae represent a growing family of small animal viruses. Some of these viruses have veterinary and medical importance, although, a vast amount of these newly discovered viruses have unknown effects on their ho... Circoviridae represent a growing family of small animal viruses. Some of these viruses have veterinary and medical importance, although, a vast amount of these newly discovered viruses have unknown effects on their hosts. The capsid-associated protein (Cap) of circoviruses is of interest because of its role in viral structure, immune evasion, host cell entry, and nuclear shuttling of viral components. The structure of the porcine circovirus 2 (PCV2) Cap has been solved and offered insight to these functions. Based on the crystallographic PCV2 Cap structure, models from circoviruses isolated from avian, fish, and mammalian hosts have been constructed and analyzed to better understand the roles of these proteins in the virus family. A high degree of conservation is observed in the models, however, the surface antigens differ among viruses. This is likely a reflection of the small genome harbored by circoviruses, and therefore the requirement of their few proteins to carry out specific vital functions, while maintaining enough variation to successfully infect their hosts. Here we describe the putative structures of a range of Cap proteins from circoviruses based on the crystallographic determination of porcine Cap, identifying key regions for function and inhibition of crystal formation. 展开更多
关键词 CIRCOVIRUS capsid-Associated protein Structure HOMOLOGY cap Modelling
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基于同位素标记的相对和绝对定量技术筛选双孢蘑菇采后开伞相关差异蛋白
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作者 张蕾 王华东 孟德梅 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第1期146-154,共9页
目的筛选双孢蘑菇采后开伞相关差异蛋白,探究双孢蘑菇采后开伞的分子机制。方法选用贮藏前(0d)和刚破膜开伞(6d)的双孢蘑菇子实体为实验材料,通过同位素标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTR... 目的筛选双孢蘑菇采后开伞相关差异蛋白,探究双孢蘑菇采后开伞的分子机制。方法选用贮藏前(0d)和刚破膜开伞(6d)的双孢蘑菇子实体为实验材料,通过同位素标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)蛋白质组学技术筛选与双孢蘑菇采后破膜开伞相关的差异表达蛋白,并通过GO分析、KEGG通路富集分析等生物信息学手段对差异表达蛋白进行分析鉴定。结果贮藏0 d和6 d的两组双孢蘑菇样品中共鉴定到差异表达蛋白808个,包括285个上调蛋白和523个下调蛋白。与基因组数据库比对发现,筛选到的差异蛋白仅有38个被注释,且注释蛋白主要与精氨酸代谢、核酸代谢、糖代谢和氧化反应等生物学过程密切相关。GO功能和KEGG通路富集显示开伞相关差异蛋白主要富集在质膜细胞结构中,参与氰基氨基酸代谢、苯丙烷生物合成、糖代谢、精氨酸与脯氨酸代谢等途径。结论差异蛋白涉及的信号途径和代谢过程,特别是精氨酸代谢过程,在双孢蘑菇采后开伞过程发挥重要的调控作用。 展开更多
关键词 双孢蘑菇 开伞 差异蛋白 精氨酸代谢 贮藏
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表达CSFV E2线性表位的PCV2病毒样颗粒的制备及免疫原性研究
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作者 李岩岩 张帅 +5 位作者 赵云环 任晓祥 李思琪 王文钊 左玉柱 范京惠 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期70-77,共8页
为制备携带猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169~aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(a... 为制备携带猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP),并在小鼠体内评价其免疫原性,本研究采用PCR扩增PCV2 Cap基因,利用重叠延伸PCR将PCV2 Cap蛋白的诱饵表位(aa169~aa180)替换成编码两个连续的CSFV E2蛋白线性表位(aa829~aa837)的融合基因(PCV2-Cap^(169~180)-E2^(829~837))经测序鉴定正确后克隆至载体pET-32a(+)中,构建重组质粒p-Cap-E2并采用PCR方法鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白(PCV2-Cap-E2),采用改良的镍亲和层析法纯化重组蛋白,并利用SDS-PAGE与western blot对重组蛋白的表达形式及反应原性鉴定;利用透射电镜观察纯化的重组蛋白能否形成VLP;利用本研究制备的VLP、PCV2及CSFV商品化疫苗分别免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠体内的抗体水平及细胞因子含量。SDS-PAGE结果显示,在49 ku处出现目的条带,且重组蛋白主要以可溶性形式表达,纯化得到单一的目的蛋白;western blot结果显示,重组蛋白能够与猪源PCV2多克隆抗体(PAb)、猪源CSFV PAb及HRP标记的6×His-Tag小鼠单克隆抗体(MAb)发生特异性反应,在49 ku处出现特异性条带;电镜观察可见重组蛋白形成规则的VLP;抗体的ELISA结果显示,与PBS对照相比,VLP能够诱导小鼠产生较高的PCV2及CSFV抗体水平(P<0.01),与各商品化疫苗均无显著差异。细胞因子的ELISA结果显示,与PBS对照组相比,VLP能够诱导小鼠产生较高水平的细胞因子(P<0.01)。体外病毒中和试验结果显示,VLP免疫的小鼠血清中具有中和PCV2的活性。综上所述,本实验首次在大肠杆菌中可溶性表达并获得了纯化的重组蛋白(PCV2-Cap-E2),且其能够在体外自组装成VLP,并可刺激小鼠产生针对PCV2 Cap蛋白及CSFV E2蛋白的特异性抗体,为研制针对PCV2和CSFV的新型二联VLP疫苗提供了物质基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 病毒样颗粒 猪瘟病毒E2蛋白 cap蛋白
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鸽圆环病毒浙江株△Cap基因的克隆与原核表达 被引量:14
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作者 余旭平 刘晓宁 +3 位作者 郑新添 邬栋栋 刘江梅 竺春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期680-684,共5页
根据已发表的鸽圆环病毒(PiCV)序列,在V1ORF保守序列部位设计引物(目的片段长度为629bp),对浙江某鸽养殖场的病料进行PCR扩增检测,获得阳性样品;应用设计的删除核定位信号外壳蛋白基因(△Cap)的引物,扩增获得680bp的△Cap基因,克隆于pMD... 根据已发表的鸽圆环病毒(PiCV)序列,在V1ORF保守序列部位设计引物(目的片段长度为629bp),对浙江某鸽养殖场的病料进行PCR扩增检测,获得阳性样品;应用设计的删除核定位信号外壳蛋白基因(△Cap)的引物,扩增获得680bp的△Cap基因,克隆于pMD18-T载体,进行测序;将△Cap基因亚克隆到原核表达载体pET-28a进行融合表达,SDS-PAGE电泳检测发现,△Cap融合蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的22.1%。 展开更多
关键词 圆环病毒 核定位信号 cap蛋白 表达
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抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定 被引量:18
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作者 黄立平 刘长明 +3 位作者 危艳武 张朝霞 陆月华 郭龙军 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期132-136,共5页
以纯化的杆状病毒表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(PCV2-rCap)免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了5株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、2E8、3A10、5F2和6F10。这5株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产... 以纯化的杆状病毒表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(PCV2-rCap)免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了5株稳定分泌抗PCV2-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、2E8、3A10、5F2和6F10。这5株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价分别为1∶2048000、1∶512000、1∶1024000、1∶512000、1∶1024000;其中1D2、2E8、5F2和6F10单抗亚类为IgG2a,仅3A10为IgG1;2E8、3A10、5F2和6F10单抗轻链为λ型,仅1D2轻链为κ型。Western blot结果显示,这5株单抗中2E8、3A10、5F2和6F10可与自然PCV2-Cap发生反应,而1D2无反应。IPMA和抗原捕获ELISA结果表明,1D2单抗可与PCV2病毒蛋白发生反应,而与PCV1无交叉反应;病毒中和试验证实,1D2单抗具有中和活性,是一株针对PCV2-Cap蛋白中和表位的单抗。这些单抗的制备为PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 重组cap蛋白 中和活性 单克隆抗体
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猪圆环病毒2型Rep/Rep'和Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护性试验 被引量:6
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作者 刘丹 王一平 +5 位作者 吴洪丽 危艳武 刘建波 李胜斌 魏萍 刘长明 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期916-919,共4页
猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因编码的Rep/Rep'蛋白与病毒复制酶相关,ORF2编码的Cap蛋白为病毒核衣壳,是病毒保护性抗原。为比较这3种蛋白作为亚单位疫苗的免疫保护性,本研究以重组杆状病毒表达的PCV2-rRep、-rRep'和-rCap蛋白制... 猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因编码的Rep/Rep'蛋白与病毒复制酶相关,ORF2编码的Cap蛋白为病毒核衣壳,是病毒保护性抗原。为比较这3种蛋白作为亚单位疫苗的免疫保护性,本研究以重组杆状病毒表达的PCV2-rRep、-rRep'和-rCap蛋白制备亚单位疫苗及PCV2灭活苗,分组免疫BALB/c鼠进行攻毒,以评价疫苗的免疫保护力。对PCV2-rRep和-rRep'亚单位疫苗免疫鼠血清ELISA抗体检测表明,于免疫后第14 d抗体全部转阳,第35 d抗体效价分别达到1∶42 667和1∶51 200。PCV2-rCap亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫组于第21 d抗体转阳,第35 d抗体效价分别达1∶2 133和1∶333。攻毒试验表明,PCV2-rCap亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫鼠获得完全保护;而PCV2-rRep和-rRep'蛋白亚单位疫苗免疫组无保护作用。血清中和试验表明,PCV2-rCap蛋白亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫鼠血清中和抗体效价达1∶1 600和1∶800;而PCV2-rRep和-rRep'蛋白亚单位疫苗免疫鼠血清无中和病毒能力。该研究表明,PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫保护力,可以与PCV2自然感染猪产生的抗Rep蛋白抗体相鉴别,具有良好的开发前景。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 REP Rep’和cap蛋白 亚单位疫苗 免疫保护性
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猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达及在ELISA中的初步应用 被引量:5
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作者 赵玲 朱玲 +3 位作者 郭万柱 徐志文 漆信桥 李凤勤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期808-814,共7页
本研究旨在建立以PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0mmol.L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫... 本研究旨在建立以PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0mmol.L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法。结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg.mL-1;血清最佳稀释度为1∶40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1h;血清反应时间为37℃30min;酶标二抗最适作用时间为37℃45min;底物最佳反应条件为37℃显色15min。用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2ELISA试剂盒得到的结果基本一致。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。 展开更多
关键词 圆环病毒2型 cap蛋白 间接ELISA
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猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达 被引量:4
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作者 宋云峰 肖少波 +3 位作者 曹胜波 张松林 陈焕春 金梅林 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期155-158,共4页
用EcoR酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2+。用Southern blot杂交证明该重组... 用EcoR酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2+。用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证明该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白。重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定。该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8TCID50/0.1mL。 展开更多
关键词 猪2型圆环病毒(PCV2) cap蛋白 ORF2基因 疫苗
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猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定 被引量:11
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作者 王先炜 姜平 +2 位作者 李玉峰 蒋文明 汤景元 《中国病毒学》 CSCD 2006年第1期29-33,共5页
猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本... 猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是近年来新发现的引起仔猪多系统衰弱综合症的必需病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap),其中Cap含有病毒主要抗原表位,是研究PCV2基因工程苗的主要候选目的基因。本研究利用PCR技术将Cap蛋白基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-Cap,测定其TCID50为1013.7/mL。用RT-PCR、间接ELISA、Westernblot和IPMA等方法证明了Cap蛋白在腺病毒中获得表达。该研究为发展PCV2的重组腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 Ⅱ型猪圆环病毒 cap蛋白 重组 腺病毒 构建
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