鸽圆环病毒Cap基因SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种针对鸽圆环病毒(PiCV)的快速诊断方法,试验根据PiCV的Cap保守基因序列,设计合成一对特异性引物,建立了PiCV荧光定量PCR检测方法,对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明:在最佳反应条件下,所建立的PiCV荧光定量PCR方法在1×10^(2)~1×10^(7) copies/μL标准品范围内具有良好的线性相关性,线性相关系数为0.9846;敏感性试验结果显示,该方法最低可检测到1×10^(2) copies/μL标准品,是常规PCR检测方法的100倍;特异性试验结果显示,该方法与其他常见的鸽病病原不发生交叉反应;重复性评价结果显示,批内与批间的变异系数均小于2%;所建立PiCV荧光定量PCR方法对临床病死鸽肝脏样品检测结果显示,PiCV阳性率达75.7%,高于常规PCR方法的检测阳性率(54.1%),说明该方法具有良好的适用性。可应用于对PiCV的快速检测,为PiCV的及时防控提供有力技术支持。

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4~0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。

鸭圆环病毒Cap基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定

通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。

猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立与Cap基因序列分析

建立一种检测PCV3流行毒株感染的PCR方法,并分析Cap基因序列变异情况,为PCV3流行病学调查提供技术支持。根据GenBank中公开的PCV3全基因序列,分别设计了质粒构建引物和检测引物,通过构建阳性质粒、灵敏度试验、特异性试验、临床样品检测试验以及测序分析,建立PCR检测方法。结果显示:建立的PCR方法检测的极限为50 copies/μL,以PRRSV、CSFV、PEDV、PRV、PPV、PCV-2的cDNA/DNA作为模板,用该方法扩增结果均为阴性,表明建立的方法特异性良好;应用该方法检测了285份样品,阳性39份,阳性率为13.7%。Cap基因序列分析显示,20株比对序列核苷酸同源性为87.1%~100%,SXSL1702与SXXA1812同源性为87.1%,在基因进化树中SXSL1702单独构成一个分支,提示SXSL1702株Cap基因与其他毒株有较大差异。成功建立了检测PCV3感染的PCR方法,为进一步流行病学调查和生物学特性研究奠定了基础。

猪圆环病毒3型陕西株Cap基因的克隆、序列分析及原核表达

为了克隆猪圆环病毒3型Cap基因并进行序列分析和原核表达,参考GenBank上已发表的PCV3(KY418606.1)Cap基因序列,合成1对上、下游引物,PCR扩增Cap基因,进行序列分析和原核表达。结果显示,成功克隆到642 bp的Cap基因,核苷酸序列分析显示,PCV3 Cap基因与国内分离株核苷酸同源性最高为95.97%,氨基酸分析显示Cap蛋白不含信号肽和跨膜区。经IPTG诱导后获得了分子质量约35 ku的Cap蛋白,该蛋白能与PCV3阳性血清结合,具备良好的抗原性。成功克隆并原核表达PCV3陕西株Cap基因,为进一步建立PCV3的快速检测方法和研制PCV3亚单位疫苗奠定了基础。

2017年-2019年郑州地区猪圆环病毒3型分子流行病学调查及Cap基因序列分析

为了分析2017年-2019年郑州地区猪场中猪圆环病毒3型(PCV-3)分子流行情况及代表株Cap基因序列遗传情况,采集郑州地区规模化猪场、散养猪场中患病猪的淋巴结、脾脏、肾脏及血清样品1175份,采用PCR进行PCV3检测,并选择代表株的Cap基因进行PCR检测与分析其遗传变异情况。结果表明,2017年-2019年郑州地区猪场PCV3总阳性率为14.6%,2019年阳性率最高(19.5%),呈现逐年升高的趋势;8个代表株PCV3 Cap基因序列与GenBank登录的12株参考株的同源性在92.%~100%之间;系统进化树表明7个代表株PCV3的Cap基因序列与12株参考株位于一个大的分支,另外1株单独构成一个分支,8个代表株PCV3 Cap基因个别碱基发生变化,未出现明显的遗传变异情况。研究结果为该地区猪场中PCV3流行病学调查及综合防控提供科学依据。

鸽圆环病毒Cap基因的克隆与进化分析

应用PCR方法对采集的144份血清样品进行鸽圆环病毒(Pigeon circovirus,PiCV)检测,随机选择6份阳性样品进行Cap基因的扩增、纯化,并克隆至pM D18-T载体。测序结果与已知参考毒株进行序列比对和系统进化分析。结果显示:PiCV阳性检出率为75%(108/144),说明PiCV的感染比较严重。自测的6株Cap基因核苷酸的同源性为74.0%~100.0%,与GenBank上登录的国内外14株的Cap基因的核苷酸同源性为72.1%~100.0%。通过进化树分析6株阳性样品分成两大分支:5株位于一大分支,亲缘关系较近;但HBL F株单独位于另外一大分支,与其它5株亲缘关系远。

猪圆环病毒Cap基因重组质粒的构建及对小鼠免疫效果研究

用PCR方法扩增出猪圆环病毒2型的Cap基因,将1个Cap基因、2个串联Cap基因和3个串联Cap基因定向克隆于真核表达载体pcDNA4-His/Max,构建真核表达载体pcDNA4-His/Max-Cap、pcDNA4-His/Max-2Cap和pcDNA4-His/Max-3Cap。将构建好的重组质粒以100μg/只腿部肌肉注射昆明小鼠,同时设置pcDNA4-His/Max和生理盐水对照,于首免后14d、28d再次免疫,并分别于首免后7、14、28、35、49d用ELISA方法检测小鼠抗体水平,对不同串联重组质粒免疫原性进行初步评价。结果显示,重组质粒于35d能诱导小鼠产生较高的体液免疫,2个Cap和3个Cap串联基因的免疫效果远远高于1个Cap基因的免疫效果,差异极显著(P<0.01)。

猪圆环病毒2型H株cap基因原核表达载体的构建与表达

利用PCR技术从临床病料中提取病毒DNA,扩增出猪圆环病毒PCV-2核衣壳蛋白(Cap)基因。将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建了表达载体pET-H2,转化至大肠杆菌BL21中,用ITPG诱导表达。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白主要以不溶性包涵体形式表达,与预期大小30 ku相符;Western-blotting分析表明,表达产物能与抗猪PCV2阳性血清发生反应。

猪圆环病毒2型陕西株Cap基因的原核表达

为了提高陕西地方性猪圆环的防治力,研究对一陕西地方猪圆环病毒2型毒株进行了Cap基因扩增,将扩增到的基因与p ET-32a构建表达载体,在BL21表达菌中进行原核表达,并应用western-blotting对其抗原性进行检测。结果显示,我们扩增到了大小为489 bp左右的基因片段,该基因与猪圆环病毒2型标准株Cap基因的最高核苷酸同源性约为93. 9%,氨基酸同源性约为84. 7%;其蛋白分子量约为18 ku,该蛋白能与猪圆环病毒2型阳性血清特异性结合,具有良好的抗原性。

闽粤地区PPV7与PCV2的混合感染调查及PPV7 Cap基因的遗传变异分析

【目的】调查闽粤地区猪细小病毒7型(Porcine parvovirus type 7,PPV7)与猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的混合感染情况,并掌握两地PPV7 Cap基因的分子遗传特征。【方法】收集闽粤地区69个猪场的432份发病猪血液进行PPV7和PCV2的PCR检测,并对阳性样品的PPV7 Cap基因进行克隆测序。利用DNAStar软件对两地PPV7 Cap基因的核苷酸序列及氨基酸序列进行分析,并采用Mega 7.0软件绘制遗传进化树。【结果】闽粤地区PPV7阳性率为21.99%(96/432),场阳性率为53.62%(37/69),PCV2阳性率为54.17%(234/432),两者共感染率为13.43%(58/432)。应用PCR方法成功扩增出17株PPV7 Cap基因序列。核苷酸相似性分析发现,17株PPV7 Cap基因序列之间相似性在85.6%~100%,与国内外参考毒株相似性在85.8%~99.0%。氨基酸序列比对发现,17株PPV7 Cap蛋白氨基酸序列相似性为87.6%~100%,与国内外参考毒株间的氨基酸相似性为82.6%~98.7%。基于Cap基因的遗传进化分析表明,PPV7可分为PPV7a~PPV7e 5个主要的进化分支,其中9株属于PPV7a进化分支,3株属于PPV7b分支,4株属于PPV7c分支,仅有1株属于PPV7e分支。【结论】PPV7在闽粤地区广泛流行,并且与PCV2有较高的共感染率,可能为猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease,PCVAD)的潜在致病因子。闽粤两地PPV7毒株具有丰富的遗传多样性,而PPV7a分支毒株为目前的主要优势毒株。本研究为闽粤地区PPV7的防控及疫苗研究提供理论依据及数据参考。

山西省猪圆环病毒3型感染调查及其Cap基因的遗传进化分析

为了解山西省各地市养猪场中猪圆环3型病毒(PCV3)的感染及其Cap基因的遗传变异情况,本研究通过PCR方法对2019年6月~7月采集的山西省11地市共521份猪肺脏组织样品进行PCV3检测,结果显示,山西省PCV3的总体感染率高达85.22%(444/521),大同市、长治市、吕梁市、临汾市的阳性检测率高达90%以上,朔州市、太原市的阳性检出率较低为65.38%、64.00%,说明山西省PCV3的感染率总体较高。随机抽取山西省各地市11份PCV3阳性肺脏样品进行Cap基因的PCR扩增并测序,利用DNAStar软件将其与30株PCV3参考株、3株PCV2疫苗株进行同源性及遗传进化分析。Cap基因同源性分析结果显示,11株PCV3间Cap基因的同源性为97.8%~99.5%,与PCV3参考株Cap基因的同源性为97.7%~99.7%;11株PCV3 Cap基因编码氨基酸比对分析结果显示,其与PCV2 Cap蛋白氨基酸序列的同源性为27.1%~29.0%,与PCV3参考株Cap基因编码的氨基酸同源性为97.7%~100%;11株PCV3 Cap基因进化树结果显示,4株PCV3属于PCV3b型,7株PCV3属于PCV3a型;选取的11株病毒与PCV3参考株仅于aa24、aa27、aa77、aa150有散在变异位点,且与3株PCV2疫苗株抗原表位有明显差异,据此分析可知山西省各地市流行的PCV3株同源性及整体保守性均较高。对所有病料样品进行PCV2、PRV等病毒的检测,结果发现PCV3与PCV2的混合感染率为44.53%(232/521),与其他病毒的混合感染率较低。本研究首次对山西省11地市PCV3的感染情况进行了调查,结果表明PCV3感染率较高,该地区流行的PCV3株相对保守,且与PCV2混合感染率较高,上述结果为山西省PCV感染的防控提供了参考依据。

云南省猪圆环病毒的分子流行病学调查及其2型cap基因遗传多样性分析

采用猪圆环病毒(PCV)通用PCR技术和PCV-2特异性PCR技术检测云南省2007～2008年采集的120份病猪组织样品,结果获得PCV-2阳性样品21份。选取12份有代表性的阳性样品进行cap基因的扩增、纯化,将产物克隆至pMD18-T载体测序,并与已知参考毒株进行比对及系统发育分析。结果显示,云南省12份阳性样品cap基因的核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为92.4%～99.7%和94.4%～99.6%;与国内PCV-2毒株cap基因的核苷酸和氨基酸序列同源性为89.3%～92.9%、88.4%～94.0%;与国外毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性为90.0%～99.4%、93.6%～99.6%。有25个氨基酸位点存在变异,其中14个位点位于抗原表位区;12份阳性样品可划分为3个进化分枝(1.1.1.1、1.1.2、1.2),其中1.1.2、1.2可能是新出现的分枝。

野猪源猪圆环病毒4型的发现及其Cap基因序列分析

猪圆环病毒4型(PCV4)于2019年在我国家猪中首次检测到,并发现其可能与多系统呼吸道疾病、腹泻及皮炎肾病综合征疾病有关。为了解该病毒在野猪中的流行和遗传进化特征,本研究采集江西省山区野猪组织样品25份,包含淋巴结、肾脏、脾脏,采用探针法荧光定量PCR(Taq Man qPCR)对组织样品检测,对PCV4阳性组织样品采用普通PCR扩增其Cap基因并分析其同源性及遗传进化关系。结果显示,25份样品中检测到3份PCV4阳性样品,检出率为12%(3/25);普通PCR扩增结果显示,在3份阳性样品中均扩增到约1300 bp的目的条带,测序后的序列比对分析结果显示其均为PCV4全长Cap基因序列(JXNC-2020、JXYC-2020及JXGZ-2020)。Cap基因的同源性分析显示,3个野猪源PCV4 Cap基因序列间的同源性为98.69%~100%,氨基酸序列间的同源性为97.1%~100%;与韩国野猪源PCV4流行株E115 Cap基因序列的同源性为98.11%~98.54%,氨基酸序列的同源性为96.93%~98.25%;与国内家猪源PCV4 Cap基因序列的同源性为98.54%~99.13%,氨基酸序列同源性97.37%~99.12%;与E115株相比,本研究获得的3个PCV4 Cap蛋白氨基酸序列分别存在3个及7个突变氨基酸。与国内PCV4相比,PCV4 Cap基因JXGZ-2020编码的氨基酸序列突变数明显少于其与韩国流行株相比。Cap基因的系统发育分析显示,野猪源PCV4与家猪源PCV4同属于一个分支,与圆环病毒属其他病毒处于不同分支。上述结果表明,野猪源PCV4与家猪源PCV4的亲缘关系较近,间接表明野猪可以促进PCV4的扩散与传播。本研究结果首次拓展了PCV4的宿主范围,为进一步研究PCV4的流行及基因组特征提供参考。

广西地区鸽圆环病毒Cap和Rep基因的克隆及遗传进化分析

研究旨在了解广西某肉鸽场鸽圆环病毒(PiCV) Cap和Rep基因的遗传变异情况,通过PCR技术对感染PiCV的鸽组织样品克隆Cap和Rep基因并进行测序及序列分析。结果显示,克隆的Cap和Rep基因大小分别为816 bp和954 bp。核苷酸序列同源性比对分析结果显示,克隆的Cap和Rep基因与XJ1毒株核苷酸同源性最高,分别为95.5%和97.6%。遗传进化分析结果显示,Cap和Rep基因与XJ1毒株亲缘关系较近。研究表明,广西鸽群中存在PiCV流行,其Cap和Rep基因与XJ1毒株核苷酸同源性最高,亲缘关系较近,这为广西地区PiCV的诊断及防控提供了重要参考。

福建省新发猪圆环病毒3型分子流行病学调查及其Cap基因分子特征

为了解2015―2017年福建省新发猪圆环病毒3型(PCV3)的流行现状、分子生物学特征和遗传演化规律,收集福建省不同地区186个猪场的267份疑似PCV3感染猪的组织病料进行分子流行病学调查,并对其Cap基因进行了遗传变异分析。结果显示,福建地区PCV3猪场总阳性率为30.11%,疑似样品总阳性率为21.72%,且呈逐年增高的趋势;17株PCV3福建分离株与其他17株国内外参考毒株Cap基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性较高,分别为96.0%~100.0%和96.3%~100.0%,表明这些毒株可能有相同的进化来源;氨基酸多序列比对发现,Cap基因氨基酸序列最有特征性的是第168位(R→K)和173位(L→F)的氨基酸替换,该位点的突变可能是该地区流行的PCV3毒株的一个重要分子特征;同时,抗原性分析发现第173位(L→F)的突变还位于Cap蛋白的抗原表位区内。遗传进化树分析结果表明,17株PCV3福建分离株中有2株属于3a亚型,其余15株属于3b亚型,表明当前福建地区PCV3流行毒株主要为3b亚型。

猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达

Cap蛋白是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的主要结构蛋白,能诱导免疫保护,是临床上利用血清学诊断PCV2的主要依据。本研究根据PCV2TJ株全基因核苷酸序列(GenBank登录号:KC751546)设计特异性引物,利用PCR从PCV2TJ株扩增获得Cap全基因,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET32a-Cap,经IPTG诱导获得约48ku的重组融合蛋白,Western blotting分析结果表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体和PCV2阳性猪血清均呈阳性反应。本研究成功克隆Cap全基因,构建原核表达载体,并实现Cap融合蛋白的表达,这为PCV2Cap蛋白的功能研究及诊断方法的建立和亚单位疫苗的研制奠定了基础。

猪圆环病毒2型Cap基因单核苷酸缺失突变体的构建与生物学特性

猪2型圆环病毒(PCV2)是新出现的猪传染病—断乳仔猪多系统衰竭综合征病原.为了分析PCV2基因组核苷酸缺失突变对病毒复制的影响,以PCV2-HZ0201毒株基因组为模板,采用DpnⅠ定点突变技术,构建4个位于ORF2内的单核苷酸缺失突变体感染性克隆△1376PCV2,△1377PCV2,△1378PCV2和△1379PCV2.缺失突变体转染PK-15细胞后用间接免疫荧光检测病毒的拯救效果.结果显示,△1376PCV2感染性克隆能拯救出感染性病毒粒子,△1377PCV2,△1378PCV2和△1379PCV2感染性克隆不能拯救感染性病毒粒子,说明ORF2内1376位核苷酸的缺失不影响PCV2的复制.复制能力测定结果显示,△1376PCV2的复制能力比亲本病毒高10倍左右.促炎因子IL-6的转录本与血清浓度测定结果显示,△1376PCV2感染小鼠后的IL-6转录本与蛋白表达显著高于健康小鼠,且高于亲本病毒.这些数据首次揭示,ORF2内1376位核苷酸缺失的PCV2病毒粒子被提高了复制能力,同时促进了促炎因子IL-6的转录与表达.

鸭圆环病毒Cap基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为构建鸭圆环病毒Cap基因酵母双杂交诱饵载体,以本实验室分离鉴定的DuCV GH01株Cap基因为模板,对其进行酵母密码子优化后,连接到pGBKT7载体上构建诱饵质粒,经菌落PCR、酶切鉴定以及测序后,转化酵母菌株Y2HGold感受态,检测诱饵蛋白表达以及诱饵蛋白对酵母细胞毒性和自激活现象。结果表明,优化后的Cap基因全长774bp,成功连接到诱饵载体pGBKT7中,重组质粒pGBKT7-Cap转入酵母细胞后,Western blot检测到50kD左右的蛋白条带,诱饵蛋白对酵母细胞既无毒性,又没有自激活现象。为进一步利用酵母双杂交技术筛选与Cap蛋白互作的蛋白奠定了基础。