转录抑制因子Bmi-1基因正、反义真核表达载体的构建及鉴定

[目的]克隆转录抑制因子Bm i-1基因并构建其正、反义真核表达载体,为研究其功能及其作用机制奠定基础。[方法]根据Bm i-1基因已知序列,设计合成一对引物,上下游引物分别加入XhoI和C laI的酶切位点,用反转录PCR(RT-PCR)方法从人红白血病细胞株(K562)总RNA中扩增编码Bm i-1的基因片段(1017 bp),插入克隆载体pMD18-T,构建pMD18-Bm i-1载体,经限制性核酸内切酶谱证实后,再克隆至逆转录病毒载体pLNCX2中,构建pLNCX2-Bm i-1真核表达载体,并经测序证实。然后以pLNCX2-Bm i-1为模板,物扩增Bm i-1基因起始密码子及编码锌指结构区域上下171 bp长度的核苷酸片段,并反向连接于表达载体(pLNCX2)上。[结果]DNA测序表明编码序列与读框完全正确,RT-PCR扩增出和目的片段相同的片段,正义DNA片断长度为1029 bp,反义片断长度为171 bp,Bm i-1基因被成功扩增并被克隆至真核表达载体pMD18-T和pLNCX2中。[结论]Bm i-1正义及反义片断被成功扩增,并成功构建了Bm i-1正、反义重组真核表达载体,为进一步研究该基因打下了基础。

转录因子21与KiSS-1转移抑制基因在结直肠癌中的表达及相关性分析

目的分析结直肠癌中转录因子21 (TCF21)与KiSS-1转移抑制基因(KISS1)在结直肠癌中的表达及相关性。方法应用免疫组化法检测71例结直肠癌原发灶及相应癌旁正常组织中TCF21与KISS1的表达情况,并分析其与临床特征的关系。结果结直肠癌组织中TCF21与KISS1的阳性表达率均明显低于癌旁正常组织,差异均有统计学意义(P<0.01)。有淋巴结转移、有远处转移及临床分期为Ⅲ+Ⅳ期的结直肠癌患者的结直肠癌组织中TCF21、KISS1阳性表达率均低于无淋巴结转移、无远处转移及临床分期为Ⅰ+Ⅱ期的患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。TCF21与KISS1在结直肠癌、癌旁正常组织中的阳性表达率均呈正相关(r=0.450、0.365,P<0.05)。结论结直肠癌中TCF21与KISS1的表达均与结直肠癌病理特征密切相关,二者表达呈正相关,TCF21可能正性调控KISS1表达。

肿瘤抑制候选基因-7、叉头框转录因子M1、鳞状细胞癌抗原在食管癌中的表达及意义分析

目的探讨长链非编码RNA肿瘤抑制候选基因-7(LncRNATUSC7)、叉头框转录因子M1(Foxm1)、鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)在食管癌中的表达及意义。方法我院收治的78例食管癌患者,根据肿瘤分期分为早中期组(TNM分期Ⅰ~Ⅱ期)32例与中晚期组(TNM分期Ⅲ~Ⅳ期)46例,比较两组LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表达水平,分析LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表达水平与食管癌肿瘤分期的相关性以及对食管癌肿瘤分期评估效能。结果中晚期组LncRNATUSC7水平低于早中期组,Foxm1、SCC-Ag水平高于早中期组(P<0.05)。食管癌患者LncRNATUSC7水平与肿瘤分期呈负相关,Foxm1、SCC-Ag水平与肿瘤分期呈正相关(P<0.05);三项指标评估食管癌肿瘤分期的ROC曲线AUC分别为0.914、0.871、0.795,截断值分别为0.27、1.40、5.15 ng/ml。结论不同肿瘤分期的食管癌患者LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表达水平存在明显差异,且三项指标可有效反映食管癌患者病情进展程度,可用于该病患者病情监测及治疗指导,临床应用价值较高。

锌指蛋白ZBTB20是调控肝脏甲胎蛋白基因转录的关键抑制因子

甲胎蛋白(AFP)在胎肝中高表达,出生后不久就快速下调至很低水平。有关肝脏AFP基因出生后的转录抑制机制一直是未解之谜。AFP基因的增强子、抑制区域和启动子等顺式调控元件可能参与其转录抑制的调节,但有关的关键性转录抑制因子尚不明确。我们发现了一种新型锌指蛋白ZBTB20,为研究其体内的生理功能,我们利用条件打靶技术,建立了ZBTB20的组织特异性基因敲除小鼠模型,发现肝细胞特异性ZBTB20基因敲除小鼠出生后的肝脏AFP基因一直维持近乎胎肝的高水平表达,而其肝细胞处于正常的静息状态。生化分析显示,ZBTB20具有转录抑制活性,体外可有效抑制AFP启动子的转录活性;染色质免疫沉淀和EMSA实验结果显示ZBTB20体内和体外能直接结合AFP启动子。在小鼠肝脏的发育过程中,ZBTB20基因被渐进激活,与AFP基因的表达水平呈负相关,提示激活的ZBTB20参与了AFP基因的转录抑制。上述结果表明ZBTB20是调控AFP基因表达的关键转录因子,由此我们认为肝脏ZBTB20基因出生后的表达上调及其发挥的转录抑制作用是导致AFP基因出生后快速下调的主要原因。

锌指蛋白A20能够通过减少细胞因子信号3抑制基因表达来增强白细胞介素-6/信号转导与转录激活因子3增生信号并促进肝脏再生

肝脏再生是肝损伤、肝切除和移植中一个非常重要的临床生理过程。锌指蛋白A20作为一种有效的抗炎蛋白和核因子-κB（NF-κB）的抑制蛋白，已被证实在肝细胞中具有促增殖效应，而这种效应部分是通过减少细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p21的表达来实现的。A20的C-末端（7-锌指；7Zn）和N-末端（Nter）在降低p21表达和抑制NF-κB分泌作用中都必不可少，但是它们各自也能独立引起肝细胞的增生，这说明除此之外还应有另外一种机制来解释A20在肝细胞中的促增殖效应。课题组研究发现A20可以通过减少细胞因子信号3抑制基因（SOCS3）的表达来增强白细胞介素-6（IL-6）诱导的信号转导与转录激活因子3（STAT3）磷酰化，从而促进肝细胞增殖。A20的这种新效应只与它的7Zn区域有关。相反的，A20的缺乏会导致SOCS3表达的增多，这会阻碍IL-6诱导的STAT3磷酰化进程。在小鼠肝切除再生模型中，A20的超表达会使得IL-6/STAT3信号通路下游的产物增加，而敲除A20基因后下游产物会明显减少。相对的，在A20缺乏的肝脏中IL-6/STAT3的促炎效应明显增强，而在A20过表达的肝脏中这种促炎效应则没有增强。在A20缺乏的肝脏中，位于SOCS3基因上游的调控RNA（miR203）表达显著降低。因此，研究者得出结论：A20通过下调SOCS3表达来增强IL-6/STAT3信号通路，从而促进肝细胞的增生，这种效应可能是基于miR203调控作用实现的。这项新发现可以结合已被证实的其他促增殖机制共同为进一步探索A20的促进肝脏再生和修复作用提供便利和理论依据。

Wnt抑制因子-1在肌萎缩脊髓侧索硬化症转基因小鼠中的表达变化

目的检测Wnt抑制因子-1(Wif-1)在成年肌萎缩脊髓侧索硬化症(ALS)转基因模型小鼠脊髓内的表达变化,进一步探讨Wif-1在ALS发病中的作用。方法选取ALS转基因鼠和同窝野生型鼠各54只,分别于鼠龄95d、108d、122d取材,部分鼠经4%多聚甲醛心脏灌注固定、分离脊髓、制备冷冻切片,应用免疫荧光染色技术检测脊髓内Wif-1的分布及变化;部分鼠取出脊髓、匀浆,应用RT-PCR和Western blotting方法观察不同时间点Wif-1 mRNA及其蛋白表达水平变化。结果成年ALS转基因鼠和同窝野生型鼠脊髓的中央管、灰质、白质中均可检测到Wif-1阳性细胞,在灰质内,Wif-1阳性细胞主要分布于脊髓前角;在白质内,神经元的轴突呈阳性反应。与同窝野生型鼠比较,ALS转基因鼠Wif-1阳性细胞显著增多,Wif-1 mRNA和蛋白表达在95d变化不明显,在108d、122d均有升高,差异具有统计学意义(P<0.05),其中108d升高最明显。结论在ALS转基因鼠发病过程中Wif-1阳性细胞明显增多,Wif-1 mRNA和蛋白表达升高,表明Wif-1与ALS的发生密切相关。

组织因子途径抑制物基因转移对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的研究组织因子途径抑制物基因转移对兔血管平滑肌细胞迁移的影响,探讨其抑制再狭窄的机制。方法将含有人组织因子途径抑制物基因的重组腺病毒和含β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒在体外分别转染兔血管平滑肌细胞,用X-gal染色法检测腺病毒的转染率,用逆转录聚合酶链反应方法检测转染后平滑肌细胞中组织因子途径抑制物mRNA的表达,于第13、、5及7天用玻片法检测血管平滑肌细胞迁移距离。结果感染指数为100,腺病毒的转染率可达到95%;基因转移后3天在血管平滑肌细胞中检测到组织因子途径抑制物mRNA的表达;同一浓度下转染组织因子途径抑制物基因重组腺病毒组和对照组相比迁移距离显著减少(P<0.001),并具有浓度依赖性。结论腺病毒具有较高的转染培养的血管平滑肌细胞的能力,组织因子途径抑制物基因转移能够显著抑制体外培养的兔血管平滑肌细胞迁移,并且这种抑制作用具有浓度依赖性。

拮抗凋亡转录因子基因在高转移人成骨肉瘤细胞系中的高表达

背景与目的:成骨肉瘤是青少年中最常见的恶性骨肿瘤,具有易发生肺转移的特点。尽管目前已能够成功地控制原发瘤,但是仍有30%以上的患者在5年内死于肺转移。更好地理解调节转移过程的分子机制,为设计有效的治疗方案提供生物学基础,我们用原位移植的方法建立了人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607裸鼠转移模型,用这一模型筛选出了高转移细胞系SOSP-M。本研究旨在通过比较两个细胞系的基因表达水平来克隆与骨肉瘤转移相关的基因,探讨成骨肉瘤转移的分子机制。方法:采用抑制性消减杂交技术建立人成骨肉瘤高转移细胞株SOSP-M的消减文库;用差异筛选技术筛选出阳性克隆;对部分克隆进行测序和同源性分析,用Northern杂交及反转录多聚酶链式反应技术对SOSP-M中表达上调的有意义的克隆在低转移细胞系SOSP-9607、OS-9901、高转移细胞系SOSP-M和裸鼠肺转移结节中的表达情况进行了分析。结果:在高转移细胞株SOSP-M中有2个阳性克隆均与人凋亡对抗转录因子(apoptosisantagonizingtransciptionfactor)同源(99%同源)。Northern杂交及反转录PCR证实这个基因在高转移细胞和裸鼠肺转移结节中高表达,而在低转移人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和OS-9901中表达微弱。结论:对抗凋亡转录因子在促进肿瘤细胞转移中可能起重要作用。

转录抑制因子ZHX2功能片段原核表达载体的构建及表达

目的从人正常组织中克隆人转录抑制因子ZHX2功能片段,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,纯化获得蛋白,用于下一步探讨ZHX2基因的功能。方法根据GenBank中ZHX2功能片段已知序列设计引物,从正常人组织中通过RT-PCR方法扩增ZHX2基因功能片段,克隆到原核表达载体pET28a(+)中,转化Ecoli.BL21(DE3)I,PTG诱导表达,采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果测序结果显示克隆的ZHX2基因序列正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确,Western-blot鉴定结果显示表达产物为人ZHX2功能片段特异性蛋白。结论本研究成功构建了含有ZHX2功能片段的原核融合表达载体,并实现了ZHX2功能片段的表达,获得了纯化的蛋白,为进一步研究ZHX2基因的功能奠定了基础。

肿瘤坏死因子α对人脐静脉内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂1表达及转录调控的影响

探讨肿瘤坏死因子α对人脐静脉内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂 1活性和mRNA表达的影响 ,以及纤溶酶原激活物抑制剂 1基因 5’上游序列的调控元件在该基因转录调控中的作用。体外培养人脐静脉内皮细胞 ,加入不同浓度肿瘤坏死因子α作用不同时间。采用发色底物法测定纤溶酶原激活物抑制剂 1活性 ,Northern印迹分析法测定纤溶酶原激活物抑制剂 1mRNA水平。基因重组技术构建四个含人纤溶酶原激活物抑制剂 1基因不同长度5’上游序列的荧光素酶报告基因质粒 ,瞬时转染进入内皮细胞 ,并测定荧光素酶的表达情况。运用聚合酶链反应和序列分析法对构建质粒上的三个AP 1元件分别进行定点突变。结果发现 ,不同浓度肿瘤坏死因子α作用人脐静脉内皮细胞后 ,纤溶酶原激活物抑制剂 1活性和mRNA表达量均明显增高 ;当转染质粒含有纤溶酶原激活物抑制剂 1基因上游序列 - 15 0 9 +90和 - 82 3 +90时 ,肿瘤坏死因子α使转染细胞的荧光素酶表达量比对照组明显增高 ;当转染质粒含有 - 5 5 3 +90和 - 4 7 +90时 ,肿瘤坏死因子α的诱导作用不明显。在纤溶酶原激活物抑制剂 15’上游序列的三个AP 1元件突变后 ,肿瘤坏死因子α的诱导作用明显降低。结果提示 ,肿瘤坏死因子α增强血管内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂 1活性与mRNA表达 ;?

植物病毒基因沉默抑制因子研究进展

RNAi是近年来发现的一种重要的基因沉默现象,可以介入植物的整体防御体系,在植物细胞中产生一种不确定的流动信号,使远距离组织的特异RNA序列得到降解。为利于病毒的侵染,植物、动物和昆虫的病毒同时也编码一种蛋白来对抗RNAi,这类蛋白可以抑制RNA沉默的各个步骤,称为RNAi抑制因子,本文对几个研究较清楚的植物病毒抑制因子,从其发现到主要特点、作用机制等方面进行了阐述,并且依据其特点及前景进行归类与展望。

植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC组织因子基因表达的转录调控作用

目的探讨植物雌激素α玉米赤霉醇(ZAL)影响血管内皮细胞组织因子(TF)基因表达的转录调控机制,并与内源性动物类雌激素17β联雌二醇(17β联estradiol,E2)进行比较分析。方法进行人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代培养,利用基因重组技术构建4个含人TF基因5′上游不同长度序列的荧光素酶报告基因质粒,用脂质体转染法分别转入以下6组细胞:①正常对照组;②10-7molLE2刺激组;③10-7molLZAL刺激组;④10-6molLAngⅡ刺激组;⑤10-7molLE2+10-6molLAngⅡ刺激组;⑥10-7molLZAL+10-6molLAngⅡ刺激组;测定细胞裂解液中荧光素酶比活性(relativeluciferaseactivity,RLA)的变化。结果转染pGL3TF171+71的各组细胞RLA均较低,不同刺激组之间无显著差异;AngⅡ可使质粒pGL3TF593+71,pGL3TF316+71,pGL3TF236+71荧光素酶表达大量增加,E2、ZAL均可不同程度地抑制AngⅡ的上述效应,2者间无显著差异。结论含有1个NFκB位点和2个AP1位点的-236bp～-171bp区域在E2或ZAL影响TF基因转录中有重要作用。

藏西北绒山羊子宫内膜容受性相关基因和可变剪接事件的综合分析

背景:藏西北绒山羊子宫内膜容受性是胚胎植入的关键因素,目前对于藏西北绒山羊子宫内膜容受性相关基因表达及可变剪接的认识还未明确。目的:分析并挖掘藏西北绒山羊子宫内膜容受性相关的基因和可变剪接事件。方法:在妊娠第5天和第15天(分别代表容受前子宫内膜组和容受性子宫内膜组),分别随机选取3只藏西北绒山羊,采集子宫内膜组织,苏木精-伊红染色观察组织形态,免疫组织化学检测子宫内膜容受性标志蛋白白血病抑制因子、血管内皮生长因子的表达水平;提取子宫内膜组织总RNA,质量检测合格后进行转录组测序,寻找差异表达的mRNA、长链非编码RNA、环状RNA和miRNA,进行功能预测,并分析与子宫内膜容受性相关的可变剪接mRNA和长链非编码RNA。结果与结论:(1)与容受前子宫内膜组比较,容受性子宫内膜组子宫内膜组织中白血病抑制因子和血管内皮生长因子蛋白的表达水平明显升高;(2)测序结果显示,差异表达基因多为mRNA和长链非编码RNA,包括250个上调的mRNA、193个上调的长链非编码RNA、135个下调的mRNA和123个下调的长链非编码RNA,显著富集于Wnt、Hedgehog和Hippo信号通路;(3)可变剪接事件分析显示有8个差异表达的可变剪接转录本,均为mRNA分子,其中2个下调、6个上调,与血管内皮生长因子受体信号、细胞运动和胚胎发育有关。

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列表达载体的构建及其转录水平的检测

构建猪肌生成抑制素 (MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体 ,并对mRNA进行转录水平的检测 ,为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后 ,用PCR扩增的 1.2kb目的片段与 pMD18 T载体连接 ,将克隆载体的质粒DNA与同样用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶酶解的表达载体 pET2 8a(+ )质粒定向连接 ,对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录 ,对mRNANorthern杂交进行转录水平的检测。结果 ,所得到的序列与所设计的序列完全一致 ,表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选 ;目的片段定向插入 ,阅读框架正确 ;RT PCR成功地反转录得到约 1.2kb的目的DNA片段 ,Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影 ,见到清晰的 1.

家蝇转录组丝氨酸蛋白酶抑制因子分析

目的为了寻求有效控制家蝇的分子靶标,对家蝇丝氨酸蛋白酶抑制因子的主要种类进行初步探讨。方法从家蝇转录组数据库中,筛查出所有注释为丝氨酸蛋白酶抑制因子的Unigenes,利用生物信息学分析技术,对这些Unigenes序列做比对、聚类与结构功能特点分析,并参照已报道的其他物种的丝氨酸蛋白酶抑制因子,对家蝇丝氨酸蛋白酶抑制因子进行初步分类。结果从家蝇转录组库中共筛选出133条注释为丝氨酸蛋白酶抑制因子的Unigenes,其中,值得分析的序列有59条,具有典型丝氨酸蛋白酶抑制因子结构域的有22条,它们被初步分成11类。结论本研究首次鉴定了11种家蝇丝氨酸蛋白酶抑制因子基因,为生物控制家蝇提供了重要的候选靶标。

人破骨细胞抑制因子基因的克隆和表达

目的 克隆、表达和鉴定人破骨细胞抑制因子(OPG) .方法 从培养的人胚肺成纤维细胞 (WI- 38)中提取总 RNA,经 RT- PCR获得人破骨细胞抑制因子基因 .将该基因克隆到 p GEM3zf-载体中 ,测序鉴定 .继而将 OPG基因插入 TNFHis融合表达载体中 ,4 2℃诱导表达 4～ 5 h,做 SDS-PAGE分析 .以免疫印迹法鉴定 TNFHis OPG融合蛋白的表达 .结果 DNA测序证明 ,获得了 OPG基因 ,其序列与国外文献报道不完全一致 .SDS- PAGE分析表明 ,TNFHis OPG融合蛋白获得表达 ,其 Mr为 7.1× 10 4 ku,表达量约占菌体总蛋白的 10 % .免疫印迹法鉴定显示 ,该融合蛋白可与抗 TNF-α单抗产生阳性反应 .结论 OPG基因的克隆和表达均获得了成功 .

不同发生时期的增生性瘢痕中基质金属蛋白酶及其抑制因子基因表达的变化

目的:研究基质金属蛋白酶-2(MMP-2),基质金属蛋白酶-9(MMF-9)及其抑制因子(TIMP-2)在不同形成时期的增生性瘢痕中的基因表达变化。方法:提取16例不同发生时期的增生性瘢痕和8例正常皮肤的总RNA后,分离mRNA,用RT-PCR方法检测MMP-2,MMP-9和TIMP-2基因在不同组织中的表达。结果: MMP-2,MMP-9和TIMP-2基因在正常皮肤和增生性瘢痕中都有表达。在增殖期的瘢痕中,这3种基因转录产物的灰度比值分别为(13．5±4．5),(18．4±4．7),(13．6±2．4),与正常皮肤相比明显升高(P<0．05)。在成熟期的瘢痕中这三种基因表达量恢复到正常皮肤水平。结论:MMP-2,MMP-9和TIMP-2基因表达增强可能是增生性瘢痕形成的机制之一,而MMP-2和MMP-9基因表达降低可能与增生性瘢痕达到相对稳定的成熟状态有关。

真核细胞基因转录抑制的分子机理

基因转录水平的调控是个复杂的过程，该方面的研究多集中于转录激活的机制上，但转录抑制也在基因表达中起重要作用．研究发现，核小体可抑制ＲＮＡ聚合酶、转录因子与基因的结合，阻断转录起始．另外，基因转录抑制因子也可特异性地作用于转录过程．依作用机理，这些因子又可分为被动抑制因子和主动抑制因子两种．前者主要通过与激活因子竞争性结合基因的ＤＮＡ结合位点或消弱激活因子与ＤＮＡ结合的能力而减慢转录速率；后者通过与基因阻遏元件结合，直接抑制转录的起始．

大肠癌金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达的研究

目的 了解大肠癌患者金属蛋白酶组织抑制因子 1基因表达的情况。方法 5 0例大肠癌术中取癌组织及正常大肠组织 ;提取组织总RNA ;用逆转录共扩增定量PCR方法测定其金属蛋白酶组织抑制因子子 1(TIMP 1)基因表达水平。结果 大肠癌组织金属蛋白酶组织抑制因子 1基因表达水平明显高于正常大肠组织。局部淋巴结受累者TIMP 1基因表达水平明显低于局部淋巴结未受累者。结论 金属蛋白酶组织抑制因子 1在阻止大肠癌的浸润、转移中可能起重要作用。

转录抑制因子（Transcription repressors）

这是一类能阻止转录的蛋白质因子，在基因转录的负调控中起重要作用。转录抑制因子可能通过下述4种途径达到阻止转录的作用：(1)结合在转录起始位点上或邻近序列上，阻碍转录起始复合物的形成；(2)阻碍转录激活因子的激活结构域与转录起始复合物成分接触；(3)转录抑制因子直接干扰转录起始复合物的形成或降低起始复合物的稳定性；(4)转录抑制因子与转录激活因子之间相互作用，封闭了后者的激活结构域。