寡核苷酸药物生物分析方法的研究进展

寡核苷酸药物是具有不同功能化学修饰的DNA或RNA,主要在基因水平上发挥治疗的作用。到目前为止,已经批准16种寡核苷酸药物用于临床治疗,这也导致了人们对寡核苷酸药物生物分析的兴趣日益增加。尤其需要强大的生物分析工具来研究这些药物的质量控制及体内的药代动力学研究。该篇综述总结了液相色谱、毛细管凝胶电泳、杂交酶联免疫吸附技术在检测寡核苷酸药物的优缺点,为该类药物的研究及质量控制提供一定的思路。

基于毛细管凝胶电泳的寡核苷酸纯度分析方法

在寡核苷酸的化学合成过程中,会产生与全长序列相差一个(n-1)和两个核苷酸(n-2)的杂质,因为分子质量及电荷性质与主成分差异小,难以准确定量检测。毛细管凝胶电泳具有样品用量少、速度快、灵敏度高、分离效果好、自动化程度高等优势,而普遍应用于核酸的分离和分析。采用毛细管凝胶电泳对寡核苷酸纯度进行分析,能有效分离寡核苷酸全长序列与n-1的杂质,在0.03~1.00 mg/L浓度范围内线性良好(R^(2)=0.998 8),检出限约为0.01 mg/L(信噪比S/N>3),该方法的建立将为寡核苷酸的纯度分析与质量控制提供有力的技术支撑。

高效毛细管电泳在核酸、蛋白质分析中的新进展

高效毛细管电泳以其分离效率高 ,分析速度快 ,样品和试剂用量少 ,易于实现自动化等优点 ,在核酸、蛋白质等生物样品的分析方面发挥着重要的作用并具有巨大的潜力。本文介绍了近两年来高效毛细管电泳技术的进展 ,特别是PCR CE、CE MS以及电泳芯片技术等方面的新发展 ,并综述了高效毛细管电泳在核酸、蛋白质分析方面的应用 ,同时对其前景进行了展望。

毛细管凝胶电泳法测定血浆中的癌泰得

为了进行硫代反义寡核苷酸药物癌泰得的药代动力学研究,建立了毛细管凝胶电泳测定血浆中癌泰得含量的方法.样品经强阴离子交换柱除去血浆中的蛋白和油脂,通过反相C18柱脱盐,再通过渗滤膜除去残留盐分后,以长度为24个碱基的寡核苷酸作为内标,采用毛细管凝胶电泳测定血浆中癌泰得的含量.结果表明,毛细管凝胶电泳测定血浆中癌泰得含量的线性范围为12.5～400 mg/L(r=0.999 8),日内、日间的相对标准偏差分别为0.398% ～2.46% 、2.75% ～6.07% ,回收率为99.53% ～102.1% .毛细管凝胶电泳法用于血浆中反义硫代寡核苷酸的含量测定具有良好的准确性、稳定性和重现性.

毛细管凝胶电泳法测定硫代寡核苷酸药物癌泰得的含量

癌泰得为20碱基的抑制端粒酶催化亚基hTERT的硫代反义寡核苷酸,体内、体外抗肿瘤活性评价显示其有较好的抗肿瘤活性。采用固相合成仪分别制备了癌泰得及与其碱基百分组成基本相同的硫代寡核苷酸内标,并使用制备型阴离子交换色谱和反相高效液相色谱进行纯化。采用毛细管凝胶电泳仪和单链DNA分离试剂盒测定了癌泰得的含量。所用毛细管规格为内径100μm,总长31cm,有效长度20cm;电动进样,进样电压-10kV,进样时间1s;分离电压-12 4kV;柱体温度40℃;样品储存温度为30℃;缓冲溶液为pH8 5的Tris 硼酸盐 7mol/L尿素缓冲液;紫外检测,波长为254nm。结果表明,在12 5～800mg/L时呈现良好的线性关系(r=0 99997);最低检测限为0 220mg/L;日内、日间的相对标准偏差(RSD)分别为0 449%～1 89%和1 01%～1 48%;低、中、高3种浓度的平均回收率为96 95%,RSD为6.88%。说明毛细管凝胶电泳内标法用于反义硫代寡核苷酸的含量测定结果准确、可靠。

毛细管凝胶电泳分离和检测低聚核苷酸和脱氧核糖核酸的合成产物

本文将毛细管凝胶电泳方法用于低聚核苷酸及DNA合成产物的分离检测，并探讨了低聚核苷酸的淌度与其碱基数的关系以及迁移时间和相对迁移时间的重现性。

毛细管电泳中葡萄糖-羟丙基甲基纤维素体系分离脱氧核糖核酸

葡萄糖作为羟丙基甲基纤维素 (Hydroxypropylmethylcellulose ,HPMC)筛分体系的添加剂 ,可以改善该体系在低浓度时分离脱氧核糖核酸 (DNA)的能力。研究了硼酸浓度和pH值对葡萄糖 羟丙基甲基纤维素体系分离性能的影响 ;并将葡萄糖与其它添加剂如甘油、甘露醇对分离的影响作了比较 。

激光诱导荧光毛细管电泳法优化随机寡核苷酸文库聚合酶链反应扩增的条件

寡核苷酸文库的聚合酶链反应(PCR)扩增是指数富集系统配基进化技术(SELEX)筛选适配子技术中的重要步骤。本研究采用毛细管电泳技术结合激光诱导荧光检测器(CE-LIF),通过对双链产物、PCR副产物以及剩余引物的考察,研究了寡核苷酸文库PCR扩增时的影响因素,并对其进行优化。结果表明,随机寡核苷酸文库的扩增与传统均一模板的扩增显著不同,其在扩增十几个循环时产物就达到最大值;此外,初始模板数、退火温度、DNA聚合酶浓度等条件也有所不同。因此,在进行SELEX筛选之前必须对文库PCR条件进行详细优化。本研究中N39文库优化后的PCR扩增条件为:初始模板的量为105个分子,DNA聚合酶浓度0.05U/μL,退火温度70℃,18个循环。本研究为利用SELEX技术有效筛选适配子,降低筛选的假阳性及提高特异性提供了参考依据。

毛细管电泳用于评价脱氧核糖核酸退火反应

将毛细管电泳技术用于定性和定量评价互补单链脱氧核糖核酸 (DNA)的退火反应 ,从电泳信号能直接观察退火效率。解释了双链DNA的电泳迁移特性 ,对DNA产品基质中的NaCl浓度进行了测定 ,考察了DNA样品中NaCl浓度对进样的稀释效应。在所应用的实验条件下 ,NaCl浓度在 2 0mmol L以内稀释效应的影响是可以忽略的。

脱氧核糖核酸分子在高分子溶液3个不同浓度区间的电泳迁移行为

借鉴高分子亚浓溶液线团收缩理论 ,研究了脱氧核糖核酸 (DNA)片段在高分子溶液全浓度区间的电泳迁移行为。结果表明 ,在高分子稀溶液、亚浓溶液和浓溶液 3个不同浓度区间 ,DNA的电泳迁移行为各不同 ,DNA片段的分离在这 3个浓度区间也存在差异。

单细胞凝胶电泳技术检测慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞DNA的损伤

目的 观察正常人及慢性乙型肝炎 (慢乙肝 )患者外周血淋巴细胞DNA的损伤情况。方法 利用快速、灵敏的检测细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳 (SCGE)技术结合IMI1 0慧星分析软件 ,以“彗星”尾长、尾惯量、尾 %DNA、尾矩来评价淋巴细胞DNA的损伤程度。结果 慢乙肝患者外周血淋巴细胞DNA经SCGE ,形成的“彗星”尾长、尾惯量、尾 %DNA、尾矩较健康人明显增大 (P <0 0 5 )。

毛细管电泳中聚合物溶液筛分脱氧核糖核酸

围绕着毛细管电泳中聚合物溶液筛分脱氧核糖核酸（DNA）的机理和分离介质、条件，综述了近年来该技术的发展，及其在DNA测序、聚合酶链反应（PCR）产物分析方面的应用及其发展前景。

脱氧核糖核酸-蛋白质相互作用产物的检测及其在胃癌组织中的应用

建立了无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光(Non-gel sieving capillary electrophoresis with laser inducedfluorescence,NGS-CE-LIF)检测脱氧核糖核酸(DNA)-蛋白质相互作用产物的方法。考察了筛分介质聚环氧乙烷(Poly(ethylene oxide),PEO)浓度、分离温度、分离电压及缓冲液三羟甲基氨基甲烷硼酸(Tris-Borate-ED-TA,TBE)pH值等条件对pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)DNA Marker和Protein Molecular Weight Marker(Broad)D532S相互作用产物的影响。结果表明,当PEO浓度为0.1%,TBE的pH为9.0,分离电压为15 kV,分离柱温15℃时,DNA-蛋白质相互作用产物得到有效分离。本方法应用于人胃癌组织p53基因扩增后的PCR产物和从相应组织中提取的蛋白质二者相互作用产物时,检测效率高,分离效果好。

毛细管凝胶电泳紫外检测核酸灵敏度

以已知浓度的DNA Marker为标准样品,常规压力进样,电动进样,柱头场放大及联合使用基质场放大和柱头场放大等方法进行CGE-UV分析,对比不同进样方法的检测灵敏度。以聚合酶链式反应(PCR)后的高盐DNA样品验证方法的可靠性。当DNA样品稀释达40万倍,与电动进样和压力进样相比,在对峰形和峰宽无明显影响下,将电动进样的时间延至420s,三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(TE)浓度降低至1.5%,柱头场放大灵敏度分别提高了约28和90倍;联合使用基质场放大和柱头场放大后,灵敏度分别提高3760和12000倍。DNA的检出限达0.1μg/L(S/N=3,CGE-FASI-UV)。同时以本法分析PCR后的DNA产物获得了极高的灵敏度(分别比普通的压力进样和电动进样提高50477倍和33354倍)。本实验采用基质场放大和柱头场放大联用,方法操作简单,灵敏度高,适用于高盐微量的DNA样品分析。

动力学涂层毛细管电泳分离双链脱氧核糖核酸片段

以异丙醇为聚合反应链转移试剂，水相法合成了短链聚Ｎ，Ｎ－二甲基丙烯酰胺（ＰＤＭＡ）。研究表明该聚合物能在毛细管内壁形成稳定的动力学涂层，从而有效地抑制电渗流和毛细管内壁与ＤＮＡ的作用。这种介质被成功地应用于ＤＮＡ片段的高效分离。

脱氧核糖核酸的毛细管无胶筛分电泳迁移规律研究

本文研究了不同因素对脱氧核糖核酸(DNA)毛细管电泳迁移行为的影响。采用毛细管无胶筛分电泳法,对不同片段长度DNA进行分离检测,考察DNA片度长度、电场强度、聚合物浓度及分子量等因素对DNA迁移行为的影响。实验结果显示,DNA迁移时间随其长度的增加而延长;电场强度越高,DNA迁移时间越短,分离效果变差;DNA在高浓度聚合物介质中的迁移时间较低浓度中延长;聚合物分子量越高,DNA迁移时间越长。基于对大片段DNA的分离效果考虑,毛细管无胶筛分实验中应限制高场强的使用;为了实现较小DNA片段的满意分离,应使用分子量较小的筛分介质,反之亦然。

反义寡核苷酸药物癌泰得的定性分析方法研究

癌泰得 (ACTCACTCAGGCCTCAGACT)为端粒酶表达抑制活性反义寡核苷酸 .为了探讨其定性检测手段 ,通过阴离子交换高效液相色谱和毛细管凝胶电泳分析方法 ,确定了该硫代寡核苷酸以及与其有关的短序列和部分未被硫代类似物的保留时间 ,并分析了不同混合物样品 .结果表明 ,阴离子交换高效液相色谱对硫代寡核苷酸骨架上的差异非常敏感 ,可很好地分离长度相同的硫代和未完全硫代类似物 ,并且随未被硫代磷酸基数目增加 ,保留时间依次缩短 .阴离子交换高效液相色谱对硫代寡核苷酸的长度不敏感 ,不能分离相差一个碱基的硫代寡核苷酸 .毛细管凝胶电泳可很好地分离长度相差一个碱基的硫代寡核苷酸 ,不能分离同长硫代和部分硫代寡核苷酸 .高效液相色谱结合毛细管凝胶电泳可有效地确定癌泰得的纯度和修饰程度 .

缠结聚合物溶液毛细管电泳

从缠结聚合物溶液（Ｅｎｔａｎｇｌｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）理论及其电泳迁移理论对缠结聚合物溶液毛细管电泳的现状给予综述，并就缠结聚合物溶液毛细管电泳在ＤＮＡ、蛋白质等大分子分离方面的应用进行了概述。

动力学毛细管电泳法求解蛋白质与单链脱氧核糖核苷酸结合的解离常数及可靠性分析

平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NECEEM)可用于测定复合物的解离常数(K_d)。该文以单链脱氧核糖核苷酸结合蛋白(SSB)和单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)相互作用为模型,分析了相互作用强弱的电泳图谱特征,测定了不同条件下复合物的K_d,建立了基于积分偏差的误差分析方法。结果表明,SSB与ssDNA相互作用强弱所致的电泳图差异、SSB与ssDNA的浓度比、毛细管分离温度均影响K_d的计算。此外,基于25℃时SSB与5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′(15mer)人凝血酶适配体作用模型的数值分析结果表明,在现有实验条件下,手动积分峰面积时产生的面积偏差对K_d计算结果有影响,但在10%的偏差区间内,所求K_d值的最大相对偏差小于7%,所求K_d值的误差可忽略。该文证实了基于NECEEM求解动力学相关参数的方法可靠。

毛细管电泳在核酸分析中的应用

介绍了毛细管电泳在核酸分析中的应用,对毛细管电泳用于脱氧核糖核酸测序和基因突变分析进行了较为详细的叙述,并对毛细管电泳的应用前景进行了展望.