重叠延伸PCR克隆三孢布拉霉carRA基因及其功能活性检测系统的构建

三孢布拉氏霉菌CarRA蛋白,既有番茄红素环化酶功能活性又有八氢番茄红素合成酶功能活性,为了对CarRA蛋白进行双功能活性分析,及探测CarRA蛋白的番茄红素环化酶功能活性位点,构建了在大肠杆菌体内通过颜色互补检测两种酶活性的系统。通过重叠延伸PCR的方法克隆得到了carRA基因,并构建原核表达载体pET28a-carRA,与携带crtI/crtB/crtE基因簇的质粒pAC-LYC共转化BL21(DE3),验证番茄红素环化酶功能活性;与以pAC-LYC为基础构建的携带crtI/crtE基因簇的质粒pAC-LYC△(crtB)共转化BL21(DE3),验证八氢番茄红素合成酶功能活性。通过颜色互补的初步鉴定,再以HPLC对代谢产物进行分析,明确了实验中的CarRA蛋白功能活性检测系统的可靠性,为定点突变番茄红素环化酶活性位点而不影响八氢番茄红素合成酶功能活性提供了筛选模型。

三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶多克隆抗体的制备及鉴定

对三孢布拉氏霉菌番茄红素环化酶(CarRA)进行抗原表位分析并制备兔多克隆抗体。运用GOLDENKEY分子生物学软件对三孢布拉氏霉菌CarRA结构蛋白的抗原表位及其二级结构进行了分析比较,结合现有的抗原表位选取原则从中筛选了一段显示表位特征的氨基酸残基序列,应用固相合成法合成三孢布拉氏霉菌CarRA多肽,然后将其与KLH偶联制成免疫原,应用于动物免疫及多克隆抗体的制备,对该多抗与三孢布拉氏霉菌CarRA的反应性进行了检测。获得了三孢布拉氏霉菌CarRA的多抗,该抗体经间接酶联免疫吸附测定法检测其效价为1:32000,Dot blot检测在三个稀释度下都出现了目的条带,证实该抗体具有较好的反应性和特异性。成功制备了三孢布拉氏霉菌CarRA多抗,为进一步明确发酵促进剂的作用机制及其对三孢布拉氏霉菌代谢网络的影响,对CarRA进行定量以及对其相关功能进行深入研究提供了有利条件。

4-硒硫酸酯多糖对人肝癌细胞Bel/7402DNA RNA及蛋白质合成的影响

目的 研究 4 -硒硫酸酯多糖体外给药对人肝癌细胞Bel 74 0 2DNA、RNA及蛋白质的抑制作用。方法 肿瘤细胞与不同浓度的药物培养 2 4h后 ,用同位素掺入实验 ,观察药物对肿瘤细胞DNA、RNA及蛋白质合成的影响。结果 4 -硒硫酸酯多糖可抑制肿瘤细胞DNA、RNA及蛋白质合成。结论 4 -硒硫酸酯多糖对瘤细胞生长的抑制作用 ,可能与抑制瘤细胞DNA。

4-硒硫酸酯多糖体外抗瘤作用及机制的研究

目的 研究 4 -硒硫酸酯多糖体外给药的抗瘤作用及可能的机制。方法 采用体外生长抑制实验 ,台盼蓝排染法计数活细胞 ,计算抑制百分率 ;同位素掺入实验 ,观察药物对肿瘤细胞DNA合成的影响 ;流式细胞仪分析其对细胞周期的影响。结果 4 -硒硫酸酯多糖对肿瘤细胞有直接细胞毒作用 ,可抑制肿瘤细胞DNA的合成 ,使G1期细胞减少 ,停留在S期。结论 4 -硒硫酸酯多糖体外给药对瘤细胞有明显的抑制作用 ,其机制可能与抑制瘤细胞DNA合成有关。

4-硒硫酸酯多糖的体内抗瘤作用

目的 观察 4-硒硫酸酯多糖 (Se-carra)的体内抗瘤作用。方法 于小鼠右腋皮下接种瘤细胞 2 4h后开始给药 ,连续 10天 ,观察其抑瘤率 ;小鼠腹腔接种肿瘤细胞前或接种后连续给药 10天 ,观察动物的生存时间。结果 4-硒硫酸酯多糖能明显抑制肿瘤细胞的生长 ,延长小鼠的生存期。结论 4-硒硫酸酯多糖体内给药有良好的抗瘤效果 ,值得进一步研究。

固定化产氨短杆菌连续生产L-苹果酸的研究

本文研究了K-卡拉胶固定化产氨短杆菌连续生产L-苹果酸技术。用0.4％胆酸处理固定化细胞,能有效地抑制反应副产物生成。在固定化介质中添加1.5％多胺试剂,可以提高延胡索酸酶活性50％。采用柱式反应器连续生产L-苹果酸,37 C稳定工作40天,空间流速0.22小时,转化率在85％以上。固定化细胞酶的半衰期为100天,转化液经多步提纯得列白色晶体,提取收率55％。产品经纸层析,红外光谱分析和熔点测定与L-苹果酸标准品一致。