流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应

目的探讨应用流式细胞术和活细胞荧光染料CFSE检测T淋巴细胞各亚群增殖反应的方法学。方法人外周血单个核细胞(PBMC)经CFSE染色后,分别用植物凝血素(PHA)、CD3mAb和结核杆菌抗原(Mtb-Ag)刺激,加IL-2扩增后,用流式细胞术检测活化增殖后T细胞各亚群的比例,并用ModFit软件分析各亚群的增殖动力模型。结果PHA和CD3mAb主要活化总T细胞,CD8+T细胞的增殖优于CD4+T细胞,但CD4+T细胞前4代细胞明显多于CD8+T细胞。Mtb-Ag主要刺激γδT细胞增殖。结论以CFSE标记淋巴细胞,结合流式细胞术可有效检测出不同T细胞亚群对不同刺激剂的增殖反应以及增殖动力学变化。

流式细胞术三种染色方法检测体外纯化扩增的NK细胞的细胞毒作用比较

目的:比较流式细胞术3种不同染色方法检测体外诱导扩增后NK细胞的细胞毒活性效果。方法:收集健康志愿者外周血,体外诱导扩增NK细胞,在培养第17天后分为3组,每组按10∶1、20∶1、40∶1 3个效靶比混合,共同培养4 h,并分组用3种不同方法染色后经流式细胞术检测。A组:CFSE/Annectin-V/7-AAD三色荧光染色法;B组:Annectin-V/PI双色荧光染色法;C组:CFSE/PI双色荧光染色法。结果:培养17 d后,NK细胞(CD3-CD56+)由培养第0天(16.34±10.51)%增加到(83.63±10.63)%(P<0.05)。3种染色方法检测结果均显示,扩增后NK细胞对K562细胞具有显著细胞毒活性:A组NK细胞对K562细胞的细胞毒活性均明显高于B和C组(P<0.05),当效靶比为10∶1时,A、B和C 3个组细胞毒活性分别为(36.56±3.69)%、(22.35±2.71)%和(10.85±2.09)%;当效靶比为20∶1时细胞毒活性分别为(47.83±5.52)%、(39.07±5.55)%和(29.61±4.81)%;当效靶比为40∶1时细胞毒活性则分别为(67.7±4.77)%、(51.51±4.43)%和(44.12±5.62)%,差异均有显著统计学意义(P<0.05)。结论:健康者外周血经体外分离培养,可得到高纯度NK细胞;流式细胞检测技术CFSE/Annectin-V/7-AAD三色荧光染色法能特异性地和灵敏地检测NK细胞的细胞毒活性。

CFSE标记的淋巴细胞增殖实验检测方法的建立

目的建立基于流式细胞术和活细胞荧光染料CFSE的淋巴细胞增殖、单向混合淋巴细胞实验的免疫学检测方法。方法分离单个核细胞,将反应细胞经CFSE染色后,分别加入不同的淋巴细胞增殖刺激物或与灭活的异基因淋巴细胞共培养。培养后细胞经流式细胞术检测标记细胞是否增殖,应用CD4-PE抗体检测增殖细胞中CD4阳性T细胞亚群比例,ModFit软件分析增殖动力模型。计算增殖CDI或PI指数。结果基于CFSE建立的淋巴细胞增殖实验,经不同刺激物或异基因抗原刺激后增殖指数明显升高,使用CD4-PE抗体进行再次标记后可以对增殖实验中CD4阳性淋巴细胞亚群的增殖进行评估。结论成功建立了基于CFSE标记淋巴细胞的增殖实验检测方法,该方法简单、实用、灵敏度高,可以取代3H或MTT用于不同条件、不同免疫刺激情况下淋巴细胞增值的检测或评估。

标记后转输的凋亡细胞流式细胞术体内示踪方法

目的探索一种可用于转输凋亡细胞体内示踪研究的方法。方法首先对分离所得活细胞进行(CFSE)荧光标记,再诱导细胞凋亡。将该细胞经静脉注射入受体后,采用流式细胞术和组织学荧光显微镜观察标记凋亡细胞在不同组织的动态分布。同时进行CFSE标记稳定性观察实验。结果CFSE标记凋亡细胞的阳性率高,荧光强度大,不会迅速衰减和外漏。流式细胞术检测可发现标记凋亡细胞在不同组织的动态分布。结论CFSE标记细胞后诱导凋亡,再经流式细胞术检测组织内细胞分布,必要时辅以组织学检测可以作为一种可靠、高效、经济的凋亡细胞体内示踪研究技术方法。

小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性检测方法的建立

目的在建立既能保留人肿瘤生物学特性的,且免疫功能相对正常的人肿瘤异种移植动物模型的过程中,为保证小鼠脾淋巴细胞对人肿瘤细胞杀伤作用的考察效率,摸索建立基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法。方法用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记人HepG2细胞,利用无水乙醇模拟杀伤人HepG2细胞,用碘化丙啶(PI)染色,流式细胞仪检测,确定CFSE和PI的浓度及作用时间。以小鼠脾细胞为效应细胞,人HepG2细胞为靶细胞,从效靶作用时间和效靶比方面进行优化,确定试验方法的最佳条件。结果采用CFSE/PI双标记将细胞分为CFSE^+PI-、CFSE^+PI^+、CFSE-PI^+和CFSE-PI-4个组群,可有效区分活细胞和被杀伤细胞。CFSE标记靶细胞的浓度采用2.5μmol/mL,效靶作用时间为12 h,效靶比10∶1。结论建立了基于流式细胞术的评价小鼠脾淋巴细胞对人HepG2细胞杀伤活性的方法,该方法的建立可为评价动物脾淋巴细胞对异种细胞的杀伤作用提供参考。

疫苗诱导的特异性细胞杀伤活性检测方法的建立

目的建立一种基于流式细胞术的评价疫苗诱导的特异性细胞杀伤活性的方法,以完善疫苗及基因治疗药物的评价方法。方法用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE)标记淋巴细胞,利用肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNFα)模拟杀伤淋巴细胞,用碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色,流式细胞仪检测,确定CFSE和PI的浓度及作用时间。利用已确知有较强细胞免疫作用的治疗性乙型肝炎疫苗免疫小鼠,分离特异性淋巴细胞并用特异性肽刺激,分离未免疫小鼠的淋巴细胞作为靶细胞,并用特异性抗原肽致敏,并从靶细胞的标记、效应细胞培养时间,效靶作用时间、效靶比几方面进行优化,确定试验方法的操作流程。结果采用CFSE/PI双标记能有效分离实验所需各组群,细胞分为CFSE+PI-、CFSE+PI+、CFSE-PI+、CFSE-PI-4个组群,可区分活细胞和凋亡细胞。CFSE标记靶细胞的时间为6 h;效应细胞培养时间为72 h;效靶作用时间为6 h;效靶比可使用100∶1和50∶1。结论建立了基于流式细胞术的评价疫苗诱导的特异性细胞杀伤活性的方法,该方法可有效和精确地评价CTL杀伤效应,完善了疫苗及基因治疗药物的评价方法。