香石竹斑驳病毒(CarMV)的研究进展

香石竹斑驳病毒(CarMV)是侵染香石竹的主要病毒之一,严重影响香石竹切花产量与品质,影响其经济价值和进出口贸易。目前对香石竹斑驳病毒已有大量研究,为系统了解该病毒,笔者从CarMV的病原学、血清学和分子生物学,CarMV病害发生与检测及CarMV防治方法等方面综述了CarMV的研究现状。

昆明香石竹斑驳病毒鉴定

从表现为叶斑驳、花碎色症状的香石竹病株上获得一病毒分离物 ,经电镜负染观察 ,该病毒为直径是 2 8～ 33nm的球状粒子 ,病毒提取液经紫外光测定呈典型核蛋白吸收曲线 ,OD2 60 /OD2 80 =1 70 ;血清学反应与CarMV抗血清出现明显的沉淀线。由此 ,可基本认为该病毒分离物为香石竹斑驳病毒 (Carnationmottlevirus ,CarMV)。

我国发生的一种香石竹斑驳病毒株系的生物化学特性及互补DNA合成

以提纯的香石竹斑驳病毒BS株系为材料,抽提该病毒的RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明其RNA除有一个分子量约1.4×10~6道尔顿的主要组分外,还有一个分子量约0.55×10~6道尔顿的较弱组分。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外壳蛋白亚基分子量约38 000道尔顿,由17种共335个氨基酸残基组成。以上述RNA为模板,3’末端加多聚腺苷酸尾序后,以Oligo(dT)_(15)为引物反转录合成双链cDNA,平末端插入载体质粒P^(EMBL)9。经抗生素及杂交选择,共获得27个阳性克隆。提取质粒后酶切鉴定,拼接,获得3.7kb近全长cDNA亚克隆P^(BSCY)35.^(32)P标记cDNA探针杂交检测,对香石竹斑驳病毒具特异性,灵敏度可达1ng RNA。部分cDN A序列测定证明,所得克隆包括全长外壳蛋白基因。

香石竹斑驳病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用香石竹斑驳病毒(CarMV)免疫的BALB/c鼠脾细胞与Sp2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得5株能稳定传代且分泌抗CarMV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞,并分别制备它们的单克隆抗体腹水。5株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,其中3G1、1B9、2A9和2F8的抗体类型及亚类均为IgG1,而2F2为IgG3。W estern-b lot分析表明,5株单克隆抗体均与CarMV 38 kD的外壳蛋白亚基有特异性反应。利用2A9单抗建立的抗原包被的间接ELISA(ACP-ELISA)检测CarMV方法,病叶1∶800倍稀释、提纯CarMV病毒浓度为1 ng/mL(绝对检测量为0.1 ng)时仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA对田间香石竹样品的检测表明,CarMV在香石竹上发病很普遍。

香石竹斑驳病毒三种脱毒方法比较

本文通过花瓣愈伤组织培养、胚珠培养以及茎尖培养与抗病毒化学药物——病毒唑处理相结合等3种方法,进行香石竹斑驳病毒的脱毒试验。用指示植物法、电子显微镜及酶联免疫吸附试验方法,对各种脱病毒处理后的试管苗进行严格的病毒检测。结果表明:(1)花瓣愈伤组织培养的脱毒率可达到78.26％;(2)胚珠培养法可以完全脱毒;(3)随着病毒唑处理时间的延长,茎尖培养的脱毒率增加,用病毒唑最佳浓度5 mg/L处理不同长度的茎尖,发现3mm以内者脱毒有效,1mm者脱毒率达80％。同时用显微免疫组织化学方法追踪检查病毒唑处理后病毒在茎夫区域的分布,发现病毒唑处理4周后,生长锥中已无病毒,仅小叶中含有病毒;5周后病毒完全脱去。讨论了香石竹3种脱病毒方法的应用以及病毒唑和组织培养相结合脱病毒的可能机理。

昆明地区香石竹病毒病流行状况调查及脱病毒苗的制备

对昆明地区 3种不同生产模式下的香石竹 (DianthuscaryophyllusL .)进行了调查 ,采集样本 146号 ,利用酶联免疫法和电镜检测法对样本感染香石竹病毒的情况进行检测。结果表明昆明地区主要流行的香石竹病毒为香石竹斑驳病毒和香石竹坏死斑点病毒。以带香石竹斑驳病毒的香石竹品种“俏新郎”为实验材料 ,研究了直接剥茎尖法、高温处理结合剥茎尖法和病毒痤处理结合剥茎尖法 3种方法在脱病毒效率和茎尖成苗率的差异。实验结果表明以加热处理结合剥茎尖法脱病毒效果最好 ,0 2mm茎尖脱病毒率可达 77 78% ,加 5 %病毒痤处理对脱病毒有一定的影响 ,直接剥茎尖法脱病毒效果最差。

香石竹斑驳病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)是侵染香石竹的主要病毒。本研究从已鉴定的CarMV毒源植物中提取总RNA,克隆外壳蛋白(cp)基因后构建pET30a-CP重组质粒,并转入BL21(DE3)pLysS进行原核表达。通过对诱导温度、初菌浓度、IPTG的浓度等表达条件进行优化,目的蛋白在37℃,IPTG终浓度为1.0 mmol/L的条件下,诱导表达6 h后获得最高表达量。采用割胶的方法纯化cp蛋白,纯化后的目的蛋白免疫小鼠获得了特异性抗血清。经Western-blot检测,结果表明所制备的抗血清与诱导表达的重组蛋白及接种CarMV的香石竹样品均发生特异性结合。利用所制备抗血清对昆明地区的48个香石竹样品进行抽检,结果表明香石竹样品的带毒率为79.2%。本研究为大规模抗血清生产、检测应用和深入研究该病毒cp基因与寄主的互作奠定基础。

昆明麝香石竹斑驳病毒分离物的鉴定与提纯及高效价抗血清的制备

对引起云南鲜切花麝香石竹植株叶斑驳、花朵变小的病毒分离物应用酶联免疫吸附测定(ELISA)和电子显微镜技术(IEM)检测,直径大约28nm,经TAS-ELISA测定仅与CarMV标准抗体反应为阳性。鉴定为麝香石竹斑驳病毒(Carnation mottle vi-rus,CarMV)的分离株。对病株检测筛选后进行分离纯化,将提纯后的CarMV制备兔抗血清获得高效价的抗体,间接ELISA测定为1∶10240。

香石竹斑驳病毒的初步研究 Ⅰ 病毒的生物学及病理学变化

香石竹斑驳病毒在供试的５科１３种植物中，能侵染３科５种植物，在苋色藜、昆诺阿藜、菠菜、千日红上产生枯斑，系统侵染中国石竹，中国石竹是最理想的繁殖寄主．该病毒的钝化温度为８０℃，稀释限点为１０－５～１０－６，体外存活期为６０ｄ．电镜观察纯化病毒是直径为２８ｎｍ的球状粒子，观察病叶超薄切片，可看到在木质部导管中存在呈晶状排列或散生的病毒粒子，在细胞质中病毒则排列在鞘状膜的结构中．

组织直接印迹ELISA检测香石竹病毒

植物病毒的酶联免疫吸附分析检测技术（ELISA）的反应可以在硝酸纤维膜（NCM）上进行，称为dot－ELISA。为进一步简化实验步骤，改膜上点样为病组织直接印迹，以后则参照间接ELISA程序进行。成功地进行了香石竹斑驳病毒（CarMV）的快速检测，约比常规dot－ELISA缩短时间3h，灵敏度与聚乙烯板上的间接ELISA相似。讨论了使用辣根过氧化物酶标记抗体存在非特异性反应的可能性及克服办法。

聚乙二醇沉淀法部分提纯香石竹斑驳病毒

接种香石竹斑驳病毒四周后的高雪轮病叶用2倍体积磷酸缓冲液匀浆。滤液用氯仿和正丁醇澄清,二轮聚乙二醇(PEG)沉淀,得到具有侵染活性的部分提纯的香石竹斑驳病毒。提纯制剂的A260/280值为1.612,病毒含量5.9mg/ml。与等量福氏不完全佐剂乳化后,4次肌肉注射家兔,得到双扩散效价为1:2048的专化抗血清。结果表明,PEG沉淀结合高速离心,是部分提纯香石竹斑驳病毒的可行方法。

香石竹脉斑驳病毒（CarVMV）鉴定和抗血清制备

将纯化鉴定后的香石竹脉斑驳病毒繁殖在美国石竹上，样品匀浆，澄清，两轮聚乙二醇沉淀后，硼酸缓冲液重新悬浮．即为粗提纯的病毒制剂。紫外光谱吸收测定，Ａ２６０～２９０／２８０为１．１２，制剂纯度７１％，病毒含量２．７５ｍｇ／ｍｌ。肌肉注射家兔得到微量沉淀效价１：１０２４的抗血清。这是国内首次制备出香石竹脉斑驳病毒抗血清。

昆明地区香石竹斑驳病毒的鉴定、提纯及抗血清制备

在昆明地区栽培的香石竹上发现了香石竹斑驳病毒，人工接种可局部侵染苋色藜、墙生藜、千日红及番杏，可系统侵染昆诺阿藜和美国石竹，分别造成褪绿斑、斑驳或坏死斑。经二轮ＰＥＧ（分子量６０００）沉淀，病毒提纯量约２２０ｍｇ／ｋｇ鲜组织。电镜观察病毒颗粒直径为２８ｎｍ，等轴对称。提纯物紫外扫描呈典型病毒核蛋白吸收峰，Ａ２６０／Ａ２８０值为１．５６。提纯病毒经４次免疫家兔，所得抗血清经试管沉淀测定效价为１∶４０９６，琼脂糖双扩散效价为１∶１０２４。

香石竹斑驳病毒(CarMV)脱除对几种生理指标的影响

感染病毒的香石竹组培苗于(38.5±1)℃条件下热处理29d后,切取0.1～0.2mm的茎尖生长点无菌培养成苗后,经DAS-Elisa检测获得脱除香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)的香石竹脱毒苗,取脱毒苗与非脱毒苗的叶片,测量叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、丙二醛(MDA)、干物质含量几种生理生化指标。结果表明,脱毒苗与非脱毒苗相比:(1)叶绿素和类胡萝卜素含量增加,具有较强的光合效率;(2)与抗性生理有关的MDA含量下降,衰老减缓;(3)光合物质的形成与积累增多,干物质含量增加。

香石竹斑驳病毒(CarMV)主要基因的分子变异分析

香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus,CarMV)是侵染香石竹的主要病毒之一。本试验从12个香石竹品种中获得CarMV分离物,通过RT-PCR扩增包含p7、p9、CP 3个主要基因的片段,并对扩增产物进行克隆测序。通过序列比对发现CarMV的p7、p9、CP 3个基因有较高的稳定性,p7基因核苷酸序列相似性为98.10%,氨基酸序列相似性为97.81%,其中氨基酸的第11和14位存在显著差异;p9基因核苷酸序列的相似性为98.80%,氨基酸序列相似性为99.13%,氨基酸序列在第4位差异明显;CP基因核酸序列相似性为97.58%,氨基酸的相似性为98.43%,氨基酸序列的第164和331位的变异存在相关性,整个CP变异位点比较分散。证实p7和p9的变异位点主要集中在暴露与寄主互作相关的N端,推测这是导致病毒变异,与寄主互作变异的重要位点。

香石竹斑驳病毒(CarMVsh)外壳蛋白基因克隆及原核表达

香石竹斑驳病毒上海分离株（ＣａｒＭＶｓｈ）是从上海地区栽培的香石竹上分离并鉴定的．以提纯的病毒为材料，ＳＤＳ－酚法纯化的基因组ＲＮＡ作为模板，ＲＴ－ＰＣＲ合成并扩增外壳蛋白基因ｃＤＮＡ．ｃＤＮＡ 克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ，转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９．阳性克隆ｐＴＣａＣＰ经序列分析，证明带有全长ＣＰ 基因（１ ０４７ ｎｔ）．与Ｇｕｉｌｌｅｙ等报导的序列比较，核苷酸碱基同源率为９６．４６％ ，根据核苷酸密码子推测氨基酸的同源率为９７．７％ ．将ＣＰ 基因ｃＤＮＡ 用ＳａｃⅠ切下，插入原核表达载体ｐＴｒｃ９９Ａ，再用ＮｃｏⅠ／Ｓｍ ａⅠ切下目标片段后插入ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ－Ｂ的相应部位，转化Ｅ．ｃｏｌｉＴｏｐ１０菌株后。

香石竹斑驳病毒的抗血清制备及应用

用自昆明地区香石竹（Ｄｉａｎｔｈｏｕｓｃａｒｙｐｈｙｌｕｓ）植株上分离、提纯的香石竹斑驳病毒（ＣａｒＭＶ）为毒源，进行了腿肌肉、耳静脉、皮下和多方式多部位注射法等免疫家兔制备抗血清的比较实验．结果表明：多方式多部位注射免疫法得到的抗血清效价明显高于其它三种免疫方法所得的抗血清；获得的抗血清试管沉淀效价为１∶４０９６，琼脂糖双扩散效价可达１∶１０２４．将该抗血清用于５万余株香石竹的种苗、扦头的ＣａｒＭＶ检测中，结果如下：８１４２呈阳性结果，其中有６３９８株尚无病毒侵染症状（隐症）．这些隐症种苗隔离种植１２０ｄ后，５９０３株先后表现出病毒侵染症状，即抗血清对隐症带毒株检测的准确率达９２２６％．