基于CRISPR/Cas13a的EML4-ALK融合基因检测方法的建立

[目的]构建基于CRISPR/Cas13a蛋白的SHERLOCK技术平台,并将其应用于肺癌EML4-ALK融合基因的检测。[方法]构建EML4-ALK融合基因的质粒标准品;利用RPA和PCR技术分别扩增目的基因后进行SHERLOCK检测并比对结果,比较基于RPA和PCR扩增的SHERLOCK检测EML4-ALK融合基因的灵敏度,评估SHERLOCK检测目的基因及多种非目标基因的特异性。[结果]成功构建EML4-ALK融合基因表达质粒标准品;基于RPA和PCR扩增的SHERLOCK检测EML4-ALK融合基因的相对荧光值无显著差异,最低检测下限为10 copies/μL,且在5 min内荧光达到平台期;SHERLOCK技术仅对EML4-ALK融合基因有阳性检测信号,对EML4、ALK、EGFR T790M和EGFR L858R基因无阳性检测信号。[结论]基于SHERLOCK技术的EML4-ALK融合基因检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优势,有望为肺癌EML4-ALK融合基因的早期诊断提供重要依据。