CRISPR/Cas13a重组蛋白表达纯化及其连带剪切酶活性的鉴定

为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性LwaCas13a重组蛋白。对诱导温度和时间进行优化,结果显示,在16℃条件下诱导培养15 h时,LwaCas13a重组蛋白的可溶性表达量最高。通过镍柱亲和层析法对表达的LwaCas13a重组蛋白进行纯化,得到单一的目的条带,纯化效果较为理想。此外,通过体外转录合成了1对CRISPR RNA及靶标RNA,建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,可在37℃条件下30 min内完成检测,对靶标RNA的检出限为31.2 nmol/L。综上,成功利用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株可溶性表达了LwaCas13a重组蛋白,且纯化后的LwaCas13a重组蛋白具有良好的连带剪切酶活性,建立了LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法。

基于CRISPR/Cas13a的EML4-ALK融合基因检测方法的建立

[目的]构建基于CRISPR/Cas13a蛋白的SHERLOCK技术平台,并将其应用于肺癌EML4-ALK融合基因的检测。[方法]构建EML4-ALK融合基因的质粒标准品;利用RPA和PCR技术分别扩增目的基因后进行SHERLOCK检测并比对结果,比较基于RPA和PCR扩增的SHERLOCK检测EML4-ALK融合基因的灵敏度,评估SHERLOCK检测目的基因及多种非目标基因的特异性。[结果]成功构建EML4-ALK融合基因表达质粒标准品;基于RPA和PCR扩增的SHERLOCK检测EML4-ALK融合基因的相对荧光值无显著差异,最低检测下限为10 copies/μL,且在5 min内荧光达到平台期;SHERLOCK技术仅对EML4-ALK融合基因有阳性检测信号,对EML4、ALK、EGFR T790M和EGFR L858R基因无阳性检测信号。[结论]基于SHERLOCK技术的EML4-ALK融合基因检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优势,有望为肺癌EML4-ALK融合基因的早期诊断提供重要依据。