利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系

蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥大、收缩和缺血再灌注损伤的底物磷酸化有关。相关研究报道,先天性心脏病患者存在PRKD1基因突变,但其在心脏中的特异性功能和分子机制并未阐明。为了便于后期研究PRKD1基因在人类早期心脏发育的作用机制,本文拟利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系。首先,通过生物信息学网站筛选出两个最佳的基因敲除靶位点,合成相应靶位点的单链向导RNA (single guide RNA,sg RNA)和引物;然后,将两个靶位点的sg RNA进行体外转录,并将其与Cas9蛋白混合后共同注射到斑马鱼的1-细胞期;最后,对基因敲除后的F0、F1、F2及F3代斑马鱼的胚胎和成鱼进行有效性鉴定及表型观察。结果显示,靶位点附近出现了不同程度的碱基缺失;成功构建了F1代能够稳定遗传的prkd1基因敲除的3个亚系;与野生型相比, F3代纯合子胚胎表现出不同程度的心腔膨大、环化异常及心管线性化等畸形现象。综上可知,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼prkd1基因敲除品系,为进一步研究该基因在人类心脏发育中的特异性功能提供了有益参考,并为后期的先天性心脏病筛查和精准医疗提供了重要依据。

基于CRISPR/Cas9技术构建猪KLF4基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析

【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9技术构建Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因敲除的猪小肠上皮细胞,并探究KLF4基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响。【方法】在猪KLF4基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs(sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3),经退火形成的双链DNA与线性化pGK1.1载体连接,产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行鉴定,并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)。PCR扩增敲除位点附近序列,并通过测序判断sgRNA敲除效率;利用CruiserTMEnzyme酶切鉴定阳性细胞克隆,通过TA克隆测序鉴定敲除序列;利用Western blotting检测基因敲除细胞中KLF4蛋白表达情况。利用CCK-8和流式细胞术检测KLF4基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化。【结果】重组载体测序结果显示,sgRNAs与pGK1.1成功连接。分析敲除效率发现,3个sgRNAs均可对靶序列进行敲除,其中sgRNA3有较高的敲除效率。PCR产物经CruiserTMEnzyme酶切筛选出2个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现,KLF4基因2个等位基因序列分别缺失116和137 bp。Western blotting结果表明,KLF4基因敲除细胞中未见KLF4蛋白表达。细胞活性及细胞周期分析显示,敲除KLF4基因极显著抑制了细胞活性(P<0.01),并导致G0/S细胞周期阻滞。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KLF4基因敲除的IPEC-J2细胞,且KLF4基因敲除可抑制细胞活性,并引起G0/S细胞周期阻滞。KLF4基因敲除细胞可为进一步探究KLF4基因功能及分子机制提供材料。

利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,并探讨Pmepa1敲除对TGF-β刺激下TCMK1细胞纤维化的影响,为研究Pmepa1在纤维化模型中的作用提供细胞模型。【方法】根据CRISPR/Cas9设计原则设计靶向小鼠Pmepa1基因组序列的sgRNA序列,构建pX333载体并转染进入TCMK1细胞,采用流式分选m Cherry阳性细胞、单克隆细胞扩增和测序鉴定Pmepa1敲除细胞,Western blot验证Pmepa1基因敲除情况。采用RT-PCR和Western blot分析Pmepa1敲除对TGF-β1诱导的R-Smad的活化和纤维化的影响。【结果】将sgRNA设计在Pmepa1第2个外显子,pX333-Pmepa1质粒转染TCMK1细胞48 h后,观察到mCherry荧光蛋白的表达,流式细胞分析转染效率约为17%,pX333-Pmepa1质粒转染阳性细胞经流式分选和单克隆扩增培养,得到19个细胞克隆,对Pmepa1基因位点上sgRNA靶点序列PCR扩增测序分析发现2个双等位基因移码突变细胞,Western blot验证Pmepa1蛋白表达缺失,表明Pmepa1基因敲除TCMK1细胞株构建成功,与未敲除细胞相比,Pmepa1敲除细胞在TGF-β1刺激下,p-Smad2和p-Smad3的表达显著升高,并且促进纤维化基因Fibronectin和Collagen I的表达。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功构建Pmepa1基因敲除TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,为Pmepa1蛋白的功能研究建立了细胞模型以及Pmepa1在纤维化中的重要作用。

应用CRISPR/Cas9技术构建Tet-on调控表达uPA的人源化肝细胞嵌合小鼠

目的构建Tet-on调控小鼠肝脏特异性表达uPA基因的NOD-SCID背景的转基因小鼠,并通过人肝癌细胞移植修复小鼠亚急性肝损伤进而构建人源化肝细胞嵌合小鼠。方法采用CRISPR/Cas9技术,在gRNA引导下,Cas9核酸内切酶于Rosa26基因位点切割并编辑,插入目的基因pTight-uPA-pA-Alb promoter-rtTA-pA表达框。使目的基因能跟随染色体稳定遗传,生物学功能保持稳定。新培育的转基因小鼠分为4组:诱导组(n=17)、移植组(n=16)、未诱导组(n=5)和空白对照组(n=5)。诱导组经强力霉素诱导3周,肝脏中表达的uPA能造成小鼠肝脏亚急性损伤;再通过人肝癌细胞移植修复。移植4周后,通过小鼠血清生化学、组织病理学,评估该人源化肝细胞嵌合小鼠的效果。结果诱导组小鼠血清中uPA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)均高于未诱导组和空白对照组(P<0.01);移植组人白蛋白含量显著高于未移植组(P<0.01)。组织病理学HE染色发现人肝癌细胞参与小鼠肝组织的修复,激光共聚焦显微镜观察显示鼠肝脏中有人肝癌细胞聚集并表达人白蛋白,组化染色人角质蛋白(CK18)表达成阳性。结论新构建的转基因小鼠能通过强力霉素诱导小鼠肝脏中uPA表达,造成肝脏亚急性损伤,并通过人源肝癌细胞移植修复进而构建人源化肝细胞嵌合小鼠。

利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼ifi30基因

利用CRISPR／Cas9技术，在斑马鱼Daniorerio干扰素γ诱导蛋白30（ifi3D）基因的第一个外显子处选取靶位点，用PCR法构建gRNA，并进行体外转录。将体外转录的sgRNA和Cas9mRNA显微注射到斑马鱼1细胞期的受精卵中，实现对靶基因郑D的沉默。注射后24h检测发现，基因突变率在79％～95％之间，平均突变率为87．2％。为了获得稳定遗传的基因突变纯合系，将F0代与野生型斑马鱼进行配组，获得了3种突变类型的F1代，其突变率为30％。三种突变类型中突变1和突变2为移码突变，突变3删除了6个碱基，并未造成移码。突变1和突变2的F1代杂合个体生长发育未见异常。将杂合F1代自交，理论上将获得突变纯合个体，但仅在受精2h以内的胚胎中检测到了突变纯合个体，受精24h后的胚胎中，只有野生型和杂合型，未见突变纯合个体。推测ifi3D基因的移码突变造成了干扰素γ诱导蛋白的缺失，导致胚胎死亡。

CRISPR/Cas9技术在园艺作物中的研究进展

【目的】回顾近年来基因编辑技术在园艺作物中的研究进展,为园艺作物的基础研究与品种培育提供参考。【方法】从国内外文献资料中收集查阅CRISPR/Cas9技术在园艺作物研究中的研究报道,对其分析汇总。【结果】传统育种手段难以满足园艺作物对产量和品质日益增长的需求,CRISPR/Cas9技术为其品种改良开辟新的道路,改变园艺作物育种格局,促进其在抵御生物胁迫,响应非生物胁迫,提高果实品质和作物驯化。【结论】CRISPR/Cas9技术在园艺作物研究中是育种工作不可或缺的关键性技术。

利用CRISPR/Cas9技术构建能克隆难度序列的Stbl2^(TM)菌株

Stbl2^(TM)菌株适合克隆不稳定的外源DNA片段,但该菌株易受噬菌体侵染,且在构建某些高拷贝质粒时,难以克隆成功。利用CRISPR/Cas9技术将Stbl2^(TM)菌株的抗噬菌体相关基因fhuA和控制拷贝数的基因pcnB进行编辑,降低克隆难度,提高克隆效率。针对2个基因分别设计sgRNA,构建含有sgRNA的质粒pTarget-fhuA和pTarget-pcnB,分别将2个质粒与pCas9-Red质粒转入Stbl2^(TM)菌株中,经菌落PCR和测序验证基因正确编辑后再将2个外源质粒消除,并将2 kb的线粒体基因组序列作为外源基因,转入菌株进行最终的功能验证。结果表明:fhuA基因被成功敲除103 bp,pcnB基因被成功敲除802 bp,将高拷贝pUC57质粒转入基因编辑后的Stbl2^(TM)菌株,可明显降低质粒的拷贝数,且能正确克隆线粒体基因难度序列。该研究构建的菌株可作为后续克隆难度序列的感受态使用,还可为难度序列的基因克隆提供借鉴方法。

利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠ES细胞H2-K1基因

利用CRISPR/Cas9和ES细胞技术,在小鼠ES细胞株上敲除小鼠H2-K1基因,为研发MHCⅠ类基因人源化小鼠打下基础。设计了两个单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),分别靶向H2-K1基因的外显子2和外显子3。以p X330质粒为骨架构建表达sgRNA的打靶载体。用电穿孔转染法将构建好的质粒以及p SUPER-puro共同导入小鼠ES细胞中,实现基因敲除。在嘌呤霉素筛选后,利用PCR初步检测靶基因的敲除情况,再通过测序以及流式细胞分析确定敲除H2-K1基因的小鼠ES细胞。结果显示:利用CRISPR/Cas9技术,小鼠ES细胞的H2-K1基因被成功敲除,通过PCR检测到4个克隆为H2-K1单等位基因敲除(19.0%),2个克隆为H2-K1双等位基因敲除(9.5%)。经过测序以及流式细胞分析,2株小鼠ES细胞被确认为H2-K1双等位基因敲除。本研究利用CRISPR/Cas9技术得到H2-K1基因敲除的小鼠ES细胞株,为MHCⅠ类基因的敲除和置换提供了参考。

基于CRISPR/Cas9技术的水稻抗稻瘟病基因Pita突变体的创制

以粳稻品种‘日本晴’(Oryza sativa subsp.japonica‘Nipponbare’)为转基因受体,利用CRISPR/Cas9技术对抗稻瘟病基因Pita的第6至第25位碱基进行定点编辑,对突变体进行鉴定,筛选出不含T-DNA区的纯合突变体,并对该基因纯合突变体的稻瘟病抗性及6个稻瘟病病程相关基因的表达水平进行分析。结果表明:在获得的8株T0代阳性转基因植株中,有7株为突变体植株,包括1株杂合体和6株纯合体,突变率和纯合突变率分别为87.5%和85.7%,突变类型包括碱基置换、碱基插入和碱基缺失。通过PCR检测获得42株T1代T-DNA阴性植株,全部为纯合突变体。纯合突变体的稻瘟病抗性分析结果表明:接种稻瘟病菌小种CH199(Magnaporthe oryzae strain CH199)后,Pita基因编辑材料V1-38-5的T2代植株叶片病斑面积明显大于野生型‘日本晴’,平均病级为4.1±0.2,极显著(P<0.01)高于野生型‘日本晴’(3.0±0.2)。此外,与野生型‘日本晴’相比,V1-38-5的T2代植株PR2和PR1b基因的相对表达量在接种稻瘟病菌小种CH19912 h时较低,其PR2、PR1b、PR3和E2F基因的相对表达量在接种稻瘟病菌小种CH19924 h时也较低。研究结果显示:利用CRISPR/Cas9技术对水稻Pita基因进行定点编辑能够获得稳定遗传且更易感病的纯合突变体材料,这些材料可用于水稻抗性品种选育和品质改良,在一定程度上加速水稻定向分子育种的进程。

利用CRISPR/Cas9技术构建Bpi基因敲除小鼠

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建Bpi基因敲除的小鼠模型,并继续繁殖、鉴定及建立稳定遗传的Bpi基因敲除小鼠品系。方法针对C57BL/6小鼠Bpi基因的第2~3外显子两端设计敲除靶点,筛选高活性gRNA(guide RNA)靶点,体外转录得到sgRNA(small guide RNA)并与Cas9 mRNA一起显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵内,经胚胎移植至代孕母鼠体内,获得F0代小鼠后,通过基因型鉴定和DNA测序获得基因突变的阳性子代鼠。结果筛选到高活性gRNA靶点并成功获得体外转录产物sgRNA;与Cas9 mRNA一起通过显微注射的方式获得了64枚状态良好的受精卵并成功移植到2只代孕母鼠体内;获得了22只F0代小鼠,经PCR鉴定和DNA测序后选择一只单链缺失708 bp碱基的阳性小鼠进行扩繁,并在F1、F2代检测到该突变,且F2代成功繁育出纯合子小鼠。结论成功构建Bpi基因敲除小鼠模型,为进一步研究Bpi基因及其表达产物的生物学功能奠定了基础。

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsIAA11

【目的】OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程。利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11(ZH11)的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻产量构成因子的影响。【方法】依据CRISPR/Cas9编辑原理,在OsIAA11第1和第2外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在水稻基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与pYLgRNA-U6a和pYLgRNA-U6b载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的U6a-IAA11-T1和U6b-IAA11-T2表达盒,再将2个表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9-MT载体上,获得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重组表达载体,利用农杆菌介导法转化ZH11愈伤组织,再生培养得到T0代转基因幼苗,通过PCR扩增潮霉素抗性基因获得阳性株系。对T2代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定OsIAA11突变类型,并考察突变植株的田间农艺性状。【结果】pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12表达载体成功转化ZH11水稻愈伤组织,并获得25株转基因再生植株,经潮霉素鉴定得到20株阳性株系,从阳性植株的T2后代中鉴定出17种在2个靶点区域都发生编辑的纯合突变类型植株,除osiaa11-20-1、osiaa11-21-2、osiaa11-23和osiaa11-25在第1个靶点、以及osiaa11-22-2在第2个靶点是单碱基插入突变外,其他突变植株在第1个靶点为小片段缺失突变,在第2个靶点多为单碱基缺失突变。对17种不同基因型osiaa11突变体的农艺性状调查表明,与野生型水稻相比,突变体水稻的株高、有效穗数、穗长、穗粒数、结实率、千粒重、收获指数以及谷草比等性状未发生明显变化,而分蘖成穗率则显著降低,表明无效分蘖增多。【结论】采用CRISPR/Cas9技术对OsIAA11序列进行编辑,得到17种不同基因型的osiaa11突变体水稻,其分蘖成穗率显著降低,无效分蘖变多,表明OsIAA11参与了生长素对分蘖芽发生的调节代谢。

CRISPR/Cas9技术在卵巢癌多药耐药诊治中的应用

卵巢癌作为妇科三大恶性肿瘤之一,因较高的死亡率一直威胁着女性的生命健康。多药耐药常发生在卵巢癌患者的早期治疗过程中,导致化疗失败,甚至复发。CRISPR/Cas9技术作为高效便捷的新兴基因编辑技术,已为临床提供了多方面的帮助。为了改善卵巢癌患者的预后情况,提高患者生活质量,本文就卵巢癌逆转耐药现象在CRISPR/Cas9基因编辑技术参与下的相关机理与诊疗应用做一综述。

基于CRISPR/Cas9技术构建Atg7基因敲除的人脑微血管内皮细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术构建Atg7基因敲除的人脑微血管内皮细胞,为Atg7在脑血管的发育和参与血脑屏障形态建成的机制以及脑血管相关疾病的研究提供体外细胞模型。方法针对人Atg7第1外显子区域设计2对引导RNA序列(sgRNA),通过慢病毒转染人脑微血管内皮细胞,嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选成功转染细胞。分别采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blotting法检测敲除靶基因的mRNA和蛋白,显微镜下观察细胞形态变化。结果构建了靶向Atg7的CRISPR/Cas9质粒;通过实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光染色检测,结果表明单克隆筛选获得了Atg7稳定敲除的人脑微血管内皮细胞系;光镜下观察未发现Atg7敲除后细胞形态出现明显改变。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Atg7基因稳定敲除的人脑微血管内皮细胞,将有利于脑血管的发育和血脑屏障形态建成的机制以及脑血管相关疾病的研究。

应用CRISPR/Cas9技术制备Sema4D基因条件性敲除小鼠模型

目的:利用CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9)基因编辑技术使用C57BL/6J小鼠建立Sema4D基因条件性敲除小鼠模型,为Sema4D基因在哮喘中扮演的角色和作用机制的研究提供实验基础。方法:根据Sema4D基因第4外显子碱基序列,设计针对Sema4D基因的gRNA(guide RNA),构建gRNA表达质粒,将体外转录gRNA、Cas9 mRNA和含有loxP位点的供体载体对C57BL/6J小鼠的受精卵进行显微注射,产生目标基因敲除子代,待小鼠出生后1周左右剪小鼠脚趾进行PCR鉴定和序列分析,所获F0代founder小鼠继续与野生型小鼠合笼繁殖获取F1代小鼠,1周左右后剪取组织送检PCR。将F1靶向flox杂合小鼠与组织特异性Sftpc-CreERT2工具鼠杂交,生成F2代小鼠,该F2代小鼠对于目标等位基因是杂合的,而对于Cre转基因是阳性的。F2代自交扩繁后得到F3代的CKO(flox/flox,Sftpc-CreERT2)纯合子雄性小鼠和flox/+、flox/flox、flox/+Sftpc-CreERT2雌性小鼠交配后,得到F4代CKO小鼠。再经他莫昔芬的诱导敲除目标条件基因后,qPCR检测mSema4D的含量确认目标基因是否敲除成功。结果:获得F4代CKO敲除小鼠,qPCR结果显示经他莫昔芬诱导后获得正确的Sema4D基因条件性敲除小鼠模型。结论:成功建立C57BL/6J小鼠Sema4D条件性敲除模型,为研究Sema4D表达缺失与哮喘气道免疫炎症的相关性提供了重要工具。

利用CRISPR/Cas9技术敲除拟南芥转录因子MYB40的两种可变剪接体

MYB家族转录因子在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥着重要功能。前期研究发现强旱生植物霸王转录因子ZxMYB315参与到植物抗逆过程中,其在拟南芥中的同源基因MYB40的两种不同可变剪接体MYB40.1和MYB40.2对盐胁迫均有明显响应,但其在植物抗逆过程中的功能还未见报道。分析了在盐处理条件下MYB40.1及MYB40.2的表达模式,并利用CRISPR/Cas9技术,获得了2个MYB40.1被编辑株系,及3个MYB40.1和MYB40.2被同时编辑株系,为揭示MYB40这两种可变剪接体在拟南芥响应逆境胁迫过程中的功能和分子机理奠定了基础。

CRISPR/Cas9技术在大豆抗病虫育种中的应用前景

为减少大豆病虫害对我国大豆产量及品质的影响,需尽快培育出大豆抗病虫品种。将现有的抗病虫育种方法进行了优缺点的分析,并阐述了CRISPR/Cas9技术的优点以及在大豆育种中的应用现状,经过综合分析提出该技术的应用能够加快大豆抗病虫育种的效率,并为生产提供理论基础,因此,CRISPR/Cas9技术在大豆抗病虫育种中具有很好的应用前景。

CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究进展

利用传统方法在畜禽特定基因座上进行基因组修饰时,只能通过在体细胞中进行同源重组再经细胞核移植实现。传统同源重组方法的困难性和低效性阻碍了基因修饰在畜禽遗传育种中的广泛应用。近年来,位点特异性核酸内切酶的发现为靶向基因修饰提供了一条更直接的途径,主要由于这些酶能直接在DNA序列上进行一步式的基因编辑。成簇规律间隔短回文重复序列/Cas关联蛋白9(clustered regularly interspersed short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9,CRISPR/Cas9)是一种RNA导向的DNA内切酶,精准定位于特定的靶位点,高效完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas9技术作为精准而强大的第3代基因组编辑工具,已经成功应用于猪、牛、山羊、绵羊和鸡上,这些CRISPR/Cas9基因编辑畜禽可作为研究人或畜禽生理和病理的生物模型、生产功能性蛋白质的生物反应器或器官移植的供体。特别是在畜禽生产方面,CRISPR/Cas9基因编辑可用于改善生产遗传特性及畜产品质量,提高畜禽对疾病的抵抗力。作者对当前畜禽中特定位点基因组修饰的CRISPR/Cas9技术的原理及基因组编辑在畜禽育种中应用的最新进展进行了综述,以期为推进CRISPR/Cas9技术在畜禽育种中的研究提供参考。

基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌细胞株并分析其增殖特性

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建SETD2基因敲除鼻咽癌(NPC)细胞株,并对该细胞株的增殖特性进行分析。方法:采用RT-PCR及Western blot检测永生化鼻咽黏膜细胞系NP-69及不同分化NPC细胞系CNE1、CNE2Z和C666-1中SETD2的表达情况,筛选出SETD2高表达细胞系CNE1。应用CRISPR/Cas9技术敲除CNE1细胞中的SETD2基因,筛选SETD2稳定敲除细胞株。采用CCK-8和平板集落形成实验分析SETD2基因敲除前后CNE1细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的分布,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:与NP-69细胞相比,随着细胞分化程度的降低,SETD2在CNE1、CNE2Z和C666-1细胞中的表达逐渐下降(P <0. 01)。基于CRISPR/Cas9方法成功地从15个转染了小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)的CNE1细胞单克隆中筛选出2个SETD2稳定敲除的细胞株CNE1-SETD2-KO-#5和#9。CCK-8及平板集落形成实验结果证实,相对于CNE1-WT细胞,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞的增殖能力增强(P <0. 05);流式细胞术分析表明,CNE1-SETD2-KO-#5和#9细胞G1期减少而G2/M和S期均增加(P <0. 05); Western blot证实,SETD2敲除后增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(cyclin D1)、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)和CDK4表达增加,p21表达减少(P <0. 05)。结论:基于CRISPR/Ca9技术成功构建SETD2基因敲除NPC细胞株。NPC细胞中SETD2表达与细胞分化程度有关; SETD2表达缺失通过上调cyclin D1、cyclin B1、cyclin A2、cyclin E1、CDK2和CDK4并下调p21表达而促进细胞增殖。

CRISPR/Cas9技术在动物非编码RNA功能研究中的应用

CRISPR/Cas9系统是一种广泛存在于细菌和古菌中的免疫机制。近年来,已发展为一种快捷高效的基因编辑工具,用于研究编码或非编码RNA的功能。非编码RNA是一类不编码蛋白质的RNA,其可通过多种调控途径在动物的生长发育、疾病免疫等生理或病理过程中发挥重要的生物学功能。CRISPR/Cas9技术可以靶向核酸序列稳定敲除基因,得到敲除小鼠或细胞系,虽然其在非编码RNA功能研究中的使用干扰了邻近基因或宿主基因表达,但该技术的出现为非编码RNA功能机制的探索提供了不同的途径。本文通过简要概述CRISPR/Cas系统的发展和作用原理,并重点介绍CRISPR/Cas9技术在动物miRNA、lncRNA及circRNA功能研究中的应用,以期为相关研究提供参考。

运用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼前肾表达基因的敲除研究

CRISPR/Cas9是目前最热门的基因编辑技术,是进行基因敲除的有效手段.斑马鱼是一种常用的研究脊椎动物器官发育的模式生物,本实验选取10个斑马鱼前肾表达基因atp1a1a1,atp1a1a.2,atp1a1a.3,atp1a1a.4,atp1a1a.5,pkd2,aqp3a,bmper,isl2a和tbx2a,运用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除以研究肾脏发育.经过三代筛选,每个基因获得了至少一种移码突变.突变体的初步表型分析显示,10个基因中只有atp1a1a.2和pkd2基因突变可以导致斑马鱼胚胎发育缺陷,隐性致死,这与已经报道的突变体或基因敲降结果类似.上述结果表明CRISPR/Cas9基因编辑技术可在斑马鱼中高效地进行基因敲除,获得的突变体为以后深入研究斑马鱼前肾发育提供了重要材料.