CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究

本试验旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法检测猪生长抑素(SST)基因定点修饰靶点的活性。试验设计5个长20bp的单链导向RNA(sgRNA),即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列连接到可同时表达Cas9和sgRNA的质粒中,挑选正确克隆的质粒作为模板进行体外转录形成SST-sgRNA。利用CRISPR/Cas9体外酶切含靶点的DNA片段,根据酶切条带的灰度换算成sgRNA活性。结果显示目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入到质粒中且序列正确,以质粒为模板体外转录SST-sgRNA成功。靶位点经Cas9蛋白酶切后与标准sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比较,确定靶点SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性较高,可为在细胞水平、胚胎水平做基因定点修饰提供依据。

恒温扩增检测miRNA-21-5p系统的构建和初步评价

目的建立一种基于滚环扩增和CRISPR-Cas9系统的荧光检测miRNA-21-5p方法,并对检测性能进行初步评价。方法设计一种特异性的锁式探针识别靶标miRNA-21-5p,在大肠杆菌DNA连接酶和Phi29 DNA聚合酶的作用下,进行滚环扩增,扩增形成一条长重复单链。在Cas9酶的辅助下进行特异性识别,并形成双链DNA,然后通过加SYBR GreenⅠ荧光染料与形成双链DNA产物结合,产生荧光信号的荧光强度与双链DNA产物浓度成正比,并对该系统进行特异性和灵敏度进行分析。用构建的方法对胃癌患者血清和健康人血清进行miRNA检测,是否成功检测miRNA,同时检测两组血清中胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅠ/Ⅱ)水平,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,根据曲线下面积(AUC)分析miRNA-21-5p、胃蛋白酶原对胃癌的诊断价值。结果构建的扩增系统能检测到血清中miRNA,胃癌血清中miRNA-21-5p荧光强度高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);ROC曲线结果显示,miRNA-21-5p、PGⅠ/Ⅱ单独诊断胃癌的AUC分别为0.72、0.80,两者联合检测诊断的AUC为0.85,高于任意单个指标诊断。结论用该方法直接检测miR-21-5p操作方便快捷,不需要复杂热循环仪器,适用范围广。

人类胚胎基因编辑的伦理思考

人类胚胎基因编辑为罹患不治之症的儿童带来了福音的同时,也对人类传统观念产生了冲击,引发了一系列伦理、法律和社会争议。对此技术的伦理反思从安全性和不可预见的后果、操纵生殖细胞系、缺乏知情同意、基因编辑作为优生手段、科学主义的陷阱几个方面来探讨。面对这一新兴技术,倡导公众谨慎面对,监督科研方向;同时也指出制定"基因技术法"的必要性,加强对基因技术的伦理监管。科研人员对编辑人类胚胎基因的研究应三思而行,避免先进的技术剑走偏锋。

基因编辑技术在花卉育种中应用的研究进展

相较传统育种,基因编辑育种能够更精准、高效地改变植物的性状,获得优良的品种.目前应用基因编辑技术于花卉育种研究的报道相对较少.该文综述了基因编辑技术,特别是规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR-关联核酸内切酶9(CRISPR/Cas 9)在花卉中的研究进展及其局限性,同时还就花卉基因编辑育种的发展方向进行了讨论,希望为将基因编辑更好地应用于花卉育种提供参考.

敲除SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因稳定HeLa细胞株的构建

目的构建SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因敲除的稳定HeLa细胞株。方法分别设计并合成SOSSB1、SOSSB2和SOSSC亚基的两对靶向基因特定外显子的A、B两个单导向核酸(single guide RNA,sgRNA)及其互补链,与含BbsⅠ黏性末端的PX462载体连接,构建重组质粒。重组质粒经酶切和测序鉴定正确后,分别转染至HeLa细胞,用2μg/mL的嘌呤霉素培养筛选出稳定HeLa细胞。采用Western blot法对敲除效果进行鉴定。结果 A、B sgRNA均成功插入至PX462载体,重组质粒经酶切和测序鉴定,证明构建正确。Western blot结果表明,筛选出的SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因敲除稳定HeLa细胞株分别不表达SOSSB1、SOSSB2、SOSSC蛋白。结论成功构建了SOSSB1、SOSSB2和SOSSC基因敲除的稳定HeLa细胞株。