基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白体DNA定点内切酶体外活性建立高效基因型分析技术

建立快速、准确、高通量与简便易行的基因型分析技术对基因功能解析、分子育种与突变体鉴定研究具有重要价值。本研究的目标是利用Cas9或Cas9NG变体与单分子指导RNA(single guide RNA,sgRNA)核糖核蛋白复合体(sgRNA/Cas9-RNP或sgRNA/Cas9NG-RNP)体外DNA定点内切酶活性,建立与优化简便高效与低成本的基因型分析技术。以我们前期创制的CRISPR/Cas9定点编辑玉米ZmWx基因第7外显子区域定点突变基因编辑后代分离群体为材料,以ZmWx靶位点两侧特异引物扩增的PCR产物为底物,利用原核表达并纯化的Cas9或Cas9-NG蛋白为DNA内切酶,以体外转录的靶向ZmWx基因靶点的sgRNA或骨架序列优化的sgRNA(enhancedsgRNA,esgRNA)为Cas9或Cas9-NG酶定点活性指导元件,通过体外组装为sgRNA/Cas9-RNP复合体,对目标样本迚行酶切,以区分目标位点野生型、纯合突变体、杂合突变体基因型,并对反应体系迚行了优化。研究表明,基于esgRNA/Cas9的PCR/RNP检测技术可对ZmWx基因编辑目标突变体后代迚行快速有效的基因型鉴定;实验体系优化结果表明,esgRNA/Cas9蛋白质量比为1∶1,各为1?g,20?L反应体系,37℃酶切0.5h,可对500ng待测DNA底物充分酶切并确定基因型;esgRNA/Cas9NG反应体系优化结果表明,当esgRNA与Cas9-NG蛋白均为2μg时,37℃酶切4 h,可对500 ng DNA底物迚行酶切并实现基因型分析。利用Cas9NG拓宽靶位点检测范围的研究结果,暗示Cas9NG是以牺牲核酸酶酶切活性为代价降低了Cas9蛋白对PAM(protospacer adjacent motif,PAM)基序NGG序列的依赖性,实现PAM-NG基序识别能力,sgRNA/Cas9NG检测效率等仍有待提升与优化。本研究为基因功能解析、分子育种与突变体鉴定等研究提供了一套简便、成本低廉的技术方法,Cas9NG体外内切酶活性及其效率也为该Cas9突变体活体基因编辑技术研収提供了参考数据。