miR-502-3p通过靶向结合CBL抑制卵巢癌增殖并诱导凋亡

目的探究微小RNA 502-3p(micro RNA 502-3p,miR-502-3p)通过靶向结合Casitas B细胞淋巴瘤(Casitas B-cell lymphoma,CBL)参与卵巢癌增殖和凋亡的机制。方法下载GSE66957、GSE119056、TCGA_OV卵巢癌相关数据矩阵,分析miR-502-3p、CBL与卵巢癌的关系;构建过表达miR-502-3p、CBL的SKOV3和HO8910细胞系,分别采用细胞计数试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)、克隆形成实验、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况;通过荷瘤裸鼠实验,观察过表达CBL对肿瘤生长的影响;验证miR-502-3p与CBL的靶向关系。结果生物信息学分析显示,卵巢癌组织中CBL水平高于癌旁组织,miR-502-3p水平低于癌旁组织,CBL水平与患者预后、细胞增殖基因表达有关(P<0.05)。miR-502-3p与CBL存在靶向关系,与Vector组比较,CBL组肿瘤的体积及重量增加(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-502-3p组SKOV3、HO8910细胞中CBL蛋白表达、细胞活力、克隆数降低,细胞凋亡率升高(P<0.05),但CBL可逆转上述细胞变化。结论miR-502-3p可通过靶向下调CBL抑制卵巢癌细胞的增殖,并诱导其凋亡。

Cbl- b通过HOXA10调控miR-99a和miR-125b参与CD4^+T细胞活化的机制研究

目的:探讨卡西塔斯B细胞淋巴瘤谱系b(Cbl-b)调控CD4^+T细胞活化的机制。方法:用CCK8试剂盒检测过表达微小RNA(miR)-99a和miR-125b的小鼠淋巴瘤细胞(EL4)细胞增殖活性。取抗CD3和抗CD28抗体活化野生型(WT)和Cbl-b缺失型(Cbl^-b-/-)CD4^+T细胞,激光共聚焦观察WT和Cbl^-b-/-CD4^+T细胞中同源异型盒蛋白A10(HOXA10)的入核情况。用双荧光素酶报告系统检测HOXA10对miR-99a和miR-125b的表达调控作用。用蛋白质印迹法和双荧光素酶报告系统检测miR-99a和miR-125b对靶基因的表达水平影响。结果:在Cbl^-b-/-CD4^+T细胞中,HOXA10在抗CD3抗体单独刺激时即可入核。HOXA10入核后促进miR-99a和miR-125b表达,而过表达miR-99a和miR-125b则抑制蛋白激酶B2和3(AKT2、AKT3)、磷酸肌醇-3-激酶催化亚基A和D(PIK3CA、PIK3CD)的表达。结论:Cbl-b通过阻止HOXA10核转位来抑制miR-99a和miR-125b表达,导致AKT2、AKT3、PIK3CA、PIK3CD(AKT/PI3K)表达增加,最终抑制CD4^+T细胞活化。

特异性小干扰RNA沉默Cbl—b基因增强小鼠脾脏T淋巴细胞的免疫活性

目的观察特异性小干扰RNA（siRNA）沉默Cbl—b基因对于小鼠脾脏T淋巴细胞免疫活性影响。方法尼龙毛柱法分离T淋巴细胞，加入抗CD3抗体（1mg／L）在体外模拟T淋巴细胞活化的第一信号，脂质体转染12、24、48h后，流式细胞仪检测早、中、晚期活化标志分子CD69、CD25、CD71的表达变化；转染48h后细胞计数试剂盒（CCK-8）试剂盒检测T淋巴细胞增殖程度。结果利用特异性Cbl．bsiRNA能有效沉默T淋巴细胞Cbl-b基因，转染12h后，转染组、对照组、空白组CD69分子表达阳性率分别为（46．78±4．89）％、（21．36±2．06）％、（25．09±2．27）％（P〈0．01）；转染24h后，转染组、对照组、空白组CD25分子表达阳性率分别为（19．27±1．84）％、（8．18±0．71）％、（9．25±0．65）％（P〈0．01）；转染48h后，转染组、对照组、空白组CD71分子表达阳性率分别为（43．26±3．89）％、（23．99±1．97）％、（28．09±2．15）％（P〈0．01）；转染48h后，CCK-8试剂盒检测转染组、对照组、空白组吸光度值分别为0．763±0．063、0．356±0．039、0．383±0．015（P〈0．01）。结论利用特异性小干扰沉默Cbl—b基因能够增强小鼠脾脏T淋巴细胞免疫活性。

瘤体注射Cbl—b基因真核表达质粒转染T淋巴细胞免疫治疗小鼠前列腺癌

目的瘤体注射Cbl—b基因真核表达质粒[短发卡RNA（shRNA）一Cbl—b]转染T淋巴细胞，观察前列腺癌小鼠肿瘤生长及机体免疫水平变化。方法尼龙毛柱法提取小鼠脾脏T淋巴细胞，质粒转染shRNA-Cbl—b至T淋巴细胞；瘤体注射shRNA—Cbl—bT淋巴细胞至RM-1前列腺癌小鼠肿瘤部位，每周1次，共4次；Westernblot法检测荷瘤小鼠肿瘤组织中Cbl—b蛋白的表达，测量小鼠肿瘤体积变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测小鼠外周血中的白细胞介素（IL-2）、吖干扰素（IFN-1）、肿瘤坏死因子-β（TNF-β）水平变化。结果与阴性对照组和空白组比较，瘤体注射shRNA—Cbl-bT细胞能降低肿瘤组织Cbl-b蛋白表达，显著抑制小鼠前列腺肿瘤生长（P〈0．05）；shRNA—Cbl—b组、阴性对照组、空白组外周血中IL-2浓度分别为（560．34±21．29）、（447．05±20．11）、（445．12±15．06）ng／L（P〈0．05），IFN-1浓度分别为（435．70±22．25）、（403．37±7．15）、（380．02±14．43）ng／L（P〈0．05），TNF—β浓度分别为（306．81±9．71）、（253．15±9．34）、（253．38±15．67）ng／L（P〈0．05）。结论瘤体注射shRNA-Cbl—b T淋巴细胞能抑制小鼠前列腺肿瘤的生长，提高外周血IL-2、IFN-γ、TNF—β等细胞因子分泌水平，增强了小鼠机体抗前列腺肿瘤免疫。