CASP3与Cleaved-CASP3在肺癌中的表达及意义

目的:探讨凋亡信号分子CASP3、C-CASP3在肺癌与癌旁中的表达差异及其与临床参数的关系意义。方法:制备非小细胞肺癌患者的癌与癌旁组织石蜡标本的组织芯片。采用免疫组织化学方法检测分析CASP3、C-CASP3凋亡分子在组织中的蛋白表达水平。结果:非配对的癌(n=139)与癌旁组织(n=25)中凋亡相关分子表达水平:非参数秩和检验结果提示CASP3、C-CASP3两组间比较发现在癌组织均有显著性差异的升高表达(P<0.01);双变量相关分析显示CASP3与C-CASP3之间相关性存在统计学显著性意义。凋亡分子表达与临床病理、生存因素之间的关系:C-CASP3在非鳞癌中表达高于鳞癌(P<0.05);KaplanMeir生存曲线法分析提示Ⅰ～Ⅱ期患者中CASP3表达水平与PFS存在负相关趋势(P=0.094)。结论:肺癌组织较癌旁组织凋亡分子表达均上调,CASP3可能成为可进行药物干预的分子标志物和靶点。C-CASP3在非鳞癌中表达高于鳞癌,在非鳞癌组织类型亚群患者中CASP3更可能作为潜在的干预靶点激活为C-CASP3而促进肿瘤细胞凋亡。CASP3可能是PFS的独立预后因子。

高三尖杉酯碱通过上调casp3和casp8表达发挥对骨肉瘤细胞系的抑制作用

目的探讨高三尖杉酯碱(HHT)对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用,并探讨其可能的作用靶点和机制。方法使用不同浓度的高三尖杉酯碱处理骨肉瘤细胞系(143b及U2-OS),通过CCK-8实验检测HHT对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用,集落形成实验检测骨肉瘤细胞的克隆能力,划痕实验检测骨肉瘤细胞的迁移能力,Transwell实验检测骨肉瘤细胞的侵袭能力,流式细胞学技术检测骨肉瘤细胞的凋亡率。并通过荧光定量PCR(qPCR)实验检测经过HHT处理后骨肉瘤细胞内基因表达情况的改变,并找出HHT作用于骨肉瘤细胞内可能的靶点和机制。结果CCK-8实验证实HHT对骨肉瘤细胞143b和U2-OS的增殖具有明显的抑制作用;集落形成实验、划痕实验、Transwell实验分别证实了HHT对骨肉瘤细胞143b和U2-OS的克隆能力、迁移能力、侵袭能力存在显著的抑制作用;流式细胞学技术证实了HHT能提高骨肉瘤细胞143b和U2-OS的凋亡率;RT-qPCR实验表明HHT可以显著上调casp3和casp8的表达,验证了HHT可能是通过调控casp3和casp8进而对骨肉瘤的增殖凋亡、侵袭及转移等发挥作用。结论casp3和casp8是HHT作用于骨肉瘤细胞的靶点,HHT通过上调casp3和casp8的表达来发挥对骨肉瘤细胞的抑制作用。

几种天然产物与CASP3靶点的相互作用机制探索

目的:研究几种中药有效成分与CASP3靶点的相互作用,分析其作用机理及结构特征,为CASP3抑制剂的开发提供参考。方法:基于前期研究,本文选择几种天然产物的有效成分,采用分子对接和分子动力学方法模拟其与CASP3靶点之间的相互作用,通过作用力分析配体和靶点的作用机制。结果:筛选出的丹参酮IIA和野黄芩苷与CASP3靶点的结合能力较强,通过分子动力学方法分别获取了丹参酮IIA和野黄芩苷与CASP3结合的理论稳定结构。丹参酮IIA与CASP3中的Phe256、Ser205、Trp206等4个氨基酸残基具有疏水作用,形成1个氢键。野黄芩苷与CASP3靶点中的Ser249、Trp214、Trp206等9个氨基酸残基具有疏水作用,形成了7个稳定性不同的氢键,其中静电相互作用是其结合更为稳定的主要原因。结论:丹参酮IIA和野黄芩苷能与CASP3靶点形成较为稳定的结合结构,探索相似的结构有利于设计更有效的CASP3抑制剂。

MGMT和CASP3基因多态性与胶质瘤易感性的关联研究

目的探讨MGMT和CASP3基因多态性与胶质瘤易感性的关系。方法采用病例对照研究,应用多重单碱基SNP分型技术(SNaPshot)对组织病理学确诊胶质瘤患者90例和90名健康对照人群进行基因分型,MGMT rs12917和CASP3rs4647601两种单核苷酸多态性进行检测及分析。结果 MGMT基因rs12917和CASP3基因rs4647601的基因型和等位基因频率在胶质瘤组和对照组中的分布差异均无统计学意义(P>0.05)。结论MGMT rs12917和CASP3rs4647601位点基因多态性与胶质瘤的易感性无显著关联。

罗米地辛与阿糖胞苷联合用药在肺腺癌细胞中介导组蛋白H3K14乙酰化提高CASP3转录活性

肺癌发病率和病死率均居全球恶性肿瘤首位,有效的药物是治疗肺癌的关键。罗米地辛和阿糖胞苷是已经批准上市并应用于临床治疗的癌症化疗药物。这两种药物的联合用药是否在肺腺癌的治疗中发挥作用及其相关分子机制尚不明确。本研究通过MTT和克隆形成实验证实,罗米地辛和阿糖胞苷联合用药可以显著抑制肺腺癌细胞A549的生长(P<0.05)。体外Transwell细胞侵袭实验和划痕实验表明,联合用药可有效降低肺腺癌细胞的侵袭和转移能力(P<0.05)。同时,流式细胞分析显示,联合用药可以显著诱导肺腺癌细胞的凋亡(P<0.05),并且实时PCR和Western印迹结果提示,肺腺癌细胞A549在联合用药处理后,凋亡相关蛋白质CASP3的mRNA和蛋白质表达水平均明显升高。另外,通过检测联合用药后,A549细胞的组蛋白乙酰化修饰情况发现,H3K14位点乙酰化水平被明显上调,并且ChIP分析进一步显示,CASP3启动子区域组蛋白H3K14乙酰化水平在联合用药后明显增加(P<0.05)。本研究揭示了罗米地辛与阿糖胞苷联合用药能通过增强CASP3启动子区组蛋白H3K14乙酰化水平进而促进CASP3的转录和蛋白质表达,从而抑制肺腺癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡的分子机制。在分子和细胞水平上为罗米地辛和阿糖胞苷联合用药治疗肺腺癌提供依据,并为肺腺癌的临床治疗提供切实参考。

β-谷甾醇对增生性瘢痕成纤维细胞作用机制的网络药理学分析

背景:目前针对增生性瘢痕有效的预防和治疗措施仍然有限。而大多数植物中草药不良反应小且来源丰富,为预防和治疗增生性瘢痕提供了新的思路和方法。目的:通过网络药理学和分子对接技术探讨植物来源β-谷甾醇作用于增生性瘢痕成纤维细胞的潜在分子机制,并通过细胞学实验进行初步验证。方法:通过网络药理学方法,利用相关数据库及软件筛选β-谷甾醇的药物靶点,获取增生性瘢痕相关疾病靶点,取交集得到β-谷甾醇作用于增生性瘢痕的潜在作用(交集)靶点,使用Cytoscape软件和STRING数据库构建“药物-靶点-疾病”网络和蛋白质互作网络(PPI),同时筛选出PPI中核心作用靶点。通过DAVID数据库对交集靶点进行GO生物学功能和KEGG通路富集分析,结合文献分析进一步确立与交集靶点关系密切的信号通路及核心靶点基因,应用AutoDock软件对β-谷甾醇和核心靶点蛋白进行分子对接。采用体外细胞实验验证β-谷甾醇对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡、细胞周期分布和核心靶点基因mRNA表达的影响。结果与结论:①β-谷甾醇和增生性瘢痕的交集靶点共56个,PPI网络中筛选出10个核心靶点:酪氨酸激酶(SRC)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、载脂蛋白E(APOE)、雌激素受体1(ESR1)、固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、C-反应蛋白(CRP)、细胞间黏附分子1(ICAM1)和过氧化氢酶(CAT)。②结合文献报道和KEGG通路、GO功能分析结果,进一步认定MAPK信号通路与交集靶点关系密切,确定MAPK3(即为ERK1-MAPK)、CASP3、P53和肿瘤坏死因子为其核心靶点。③分子对接结果提示β-谷甾醇与核心靶点蛋白结合良好。④细胞实验结果表明,100μmol/L的β-谷甾醇能抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖,降低线粒体膜电位、诱导细胞凋亡(P<0.01),使G1期细胞占比增加,S期细胞占比减少(P<0.05),同时上调CASP3、P53和肿瘤坏死因子mRNA表达(P<0.05),并下调MAPK3 mRNA表达(P<0.001)。⑤上述数据证实,β-谷甾醇可能通过激活肿瘤坏死因子通路,上调CASP3和P53的表达,诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡,同时抑制ERK-MAPK通路使细胞周期阻滞从而降低增生性瘢痕成纤维细胞增殖活性。

CASP3基因R101H多态性与法洛四联症的相关性

目的探讨CASP3基因R101H多态性与法洛四联症(TOF)的相关性。方法选择TOF患儿112例(TOF组)。男69例,女43例;年龄(4.27±1.93)岁。同时选取200名健康体检儿童为健康对照组。男102例,女98例;年龄(5.68±2.17)岁。采用病例对照研究,应用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)进行CASP3基因R101H位点(NCBI SNP ID:rs146285839)多态性检测,分析基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组的分布,比较不同基因型与TOF患病风险的关系。应用SPSS 15.0软件进行统计学分析。结果在312例样本中,CASP3基因R101H多态位点存在C/T多态。R101H多态位点基因型频率在TOF组与健康对照组中的分布存在统计学差异(χ2=9.752,P=0.008),等位基因频率在TOF组与健康对照组中的分布亦存在统计学差异(χ2=11.682,P=0.001),且T等位基因携带者患TOF的风险高于C等位基因携带者(OR=1.854,95%CI 1.298～2.647)。结论 CASP3基因R101H多态性与TOF具有明显的相关性,具有T等位基因的个体TOF患病风险增高,CASP3基因可能是TOF的遗传易感基因。

CASP3和CASP7基因多态性与噪声性听力损失易感性关系

目的探讨细胞凋亡通路相关基因CASP3和CASP7多态性与中国汉族人群噪声性听力损失(NIHL)易感性之间的关联。方法研究对象来自2014年杭州市1 549名噪声接触工人听力损失的横断面调查,采用1:1配对病例对照研究,病例组为电测听双耳高频平均听阈>25 d B(A)的工人,对照组为性别、年龄、接噪工龄、工作岗位与病例匹配且双耳所有频段听阈均≤25 d B(A)的工人,共272对。PCR-LDR法检测2个SNP位点的基因型。采用多因素条件logistic回归模型分析SNP位点与NIHL的关联,并以叉生分析计算基因-环境交互作用。结果χ~2检验分析发现,CASP3基因rs1049216等位基因(C、T)频率组间分布有统计学差异(OR=0.68,95%CI=0.50~0.93),而基因型频率组间差异无统计学意义(P>0.05);CASP7基因rs10787498等位基因及基因型频率组间分布均无统计学意义(P>0.05);多因素条件logistic回归显示,CASP3基因rs1049216中,与野生基因型CC相比,突变基因型(CT+TT)为NIHL的保护因素(调整OR=0.65,95%CI=0.43~0.97);叉生分析表明rs1049216位点与文化程度、睡眠时间存在交互作用(P≤0.001),NIHL的危险性降低(OR值变小)。结论 CASP3基因rs1049216位点可能与中国汉族人群NIHL易感性有关,且可能与文化程度、睡眠时间存在交互作用。

湖羊CASP3基因的序列分析及其在临床型乳腺炎乳腺组织中的表达特征

半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3,CASP3)是半胱氨酸蛋白酶家族(caspase,CASP)中的重要成员,处于细胞凋亡有序级联反应下游,是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,其活化也成为凋亡进入不可逆阶段的标志。然而,目前有关CASP3基因在绵羊乳腺炎发生过程中的调控机制尚不清楚。因此,本试验以湖羊作为试验动物,基于课题组前期转录组测序获得的湖羊CASP3基因CDS序列,采用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构以及不同物种之间的同源性等进行了分析,并利用RT-qPCR、Western blot和免疫组织化学染色方法检测了CASP3基因在健康和患临床型乳腺炎湖羊乳腺组织中的表达与定位特征差异。生物信息学分析显示湖羊CASP3蛋白为亲水性稳定蛋白,其蛋白结构无跨膜区,属于非分泌蛋白,在进化过程中具有高度保守性。RT-qPCR与蛋白免疫印迹结果显示,在健康和临床型乳腺炎乳腺组织中均存在CASP3基因的表达,且临床型乳腺炎乳腺组织中CASP3 mRNA和蛋白的相对表达量极显著(P<0.01),高于健康组。免疫组织化学结果显示CASP3蛋白在健康乳腺组织中主要分布于乳腺上皮细胞中,而在临床型乳腺炎乳腺组织中主要分布于基质细胞和乳腺上皮细胞。提示CASP3 mRNA和蛋白在临床型湖羊乳腺组织中表达均上调,这为进一步研究CASP3基因在绵羊乳腺炎发病机制中的调控作用提供基础信息。

CASP3基因单核苷酸多态性与中国儿童川崎病的相关性研究

目的分析半胱氨酸蛋白酶3基因（caspase-3，CASP3）多态性与中国儿童川崎病（Kawasaki disease，KD）临床表型的潜在相关性，以寻找中国儿童KD发生发展的高风险分子标记。方法采用病例对照研究，实验组包括238例KD患儿，对照组包含年龄与性别组成匹配的364名非KD儿童。同时应用聚合酶链式反应一限制性片段长度多态性与DNA测序技术，对研究对象的CASP3基因包括功能性单核苷酸多态位点（single nucleotide polymorphism，SNP）rs113420705在内的3个多态位点进行基因分型，分别比较KD组与对照组、继发与不继发冠状动脉损伤（coronary artery lesions，CALs）以及静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）治疗敏感与抗性情况下这些SNP位点等位基因与基因型频率。结果KD组中rs113420705的T等位基因频率与该等位基因携带者频率均显著高于对照组。在3种常见的单倍型中，2种包含SNPrs113420705风险等位基因的单倍型更常见于KD患者组。3个SNP位点的等位基因、基因型与次等位基因携带者频率在继发与不继发CALs患者组，以及IVIG治疗敏感与不敏感患者组之间差异均无统计学意义。结论cASP3基因rs113420705与中国人群川崎病的发生存在显著的相关性，提示该SNP的风险等位基因有希望成为判断中国儿童川崎病易患性的分子遗传标记。CASP3基因风险单倍型的证实为该基因在KD发生中的作用提供了新的证据。

CASP3基因一个新的功能性SNP rs72689236与川崎病相关性的Meta分析

目的综合分析半胱氨酸蛋白酶3基因(CASP3)一个新的功能性单核苷酸多态位点(SNP)rs72689236与川崎病发生发展的相关性。方法国内外数据库中检索川崎病与CASP3基因相关性研究的文献,根据纳入与排除标准筛选文献,获取2012年11月以前公开发表的病例-对照研究与家系传递不平衡研究(TDT)的资料,结合作者的相关研究结果,评价质量后采用RevMan 5.1软件进行Meta分析。结果川崎病患者中rs72689236的A等位基因频率显著增高(P<0.001,OR=1.34,95%CI:1.24～1.46)。rs72689236风险等位基因A的携带者(AG+AA)相较于GG个体,患病风险增加约44%(P<0.001,OR=1.44,95%CI:1.27～1.65)。该SNP的风险等位基因A增加了川崎病并发冠状动脉损伤的风险(P=0.01,OR=1.51,95%CI:1.10～2.07),携带风险等位基因A的川崎病患者相比于非携带者,并发冠状动脉损伤的风险增加约59%(P=0.05,OR=1.59,95%CI:1.00～2.53)。未发现该SNP与川崎病患者静脉注射免疫球蛋白(IVIG)疗效相关联的证据。结论 CASP3基因功能性SNP rs72689236的A等位基因增加了川崎病的发生风险,该SNP的风险等位基因有可能作为川崎病并发冠状动脉损伤的易感遗传标记。目前还没有足够的证据提示该SNP对川崎病的重要治疗手段IVIG的疗效存在影响,需要更多的相关研究以进一步评价其应用于临床个体化治疗方案选择的可行性。

槲皮素激活焦亡途径抑制胃癌细胞增殖和迁移的机制研究

目的:探讨槲皮素介导焦亡途径来发挥抗胃癌作用的机制。方法:将胃癌细胞分为实验组和经槲皮素干预的对照组。CCK-8实验检测槲皮素对AGS胃癌细胞增殖的影响;细胞划痕实验检测槲皮素对胃癌细胞迁移能力的影响。蛋白印记检测(Western blot)检测槲皮素干预后AGS细胞内裂解的半胱天冬酶1(cleaved caspase-1,CASP1)、加斯德明D(gasdermin D,GSDMD)等蛋白表达差异;构建敲减半胱天冬酶3(caspase-3,CASP3)基因的AGS稳转细胞株,并检测转染效率。Western blot检测AGS与AGS(shCASP3)中GSDMD、GSDME等蛋白表达差异。经槲皮素干预后,Western blot再次检测AGS(shCASP3)内GSDMD和加斯德明E(GSDME)等蛋白表达变化。结果:体外实验表明,槲皮素对AGS细胞的增殖和迁移能力有显著抑制作用,并能上调CASP1、GSDMD等蛋白的表达。与正常AGS细胞相比,AGS(shCASP3)细胞内GSDME表达上调,经各浓度槲皮素干预培养后,AGS(shCASP3)细胞内GSDME表达趋势逆转。结论:槲皮素能够抑制胃癌细胞增殖和迁移能力,这可能与槲皮素激活CASP1/GSDMD、CASP3/GSDME信号通路进而触发焦亡途径有关。

青藤碱抗肝癌作用机制研究

目的:探讨青藤碱对Hep G2人肝癌细胞株的增生和转移能力的多靶向作用机制。方法:运用噻唑蓝还原法(MTT)来检测青藤碱对Hep G2人肝癌细胞株的抗增殖作用,而同时运用Transwell法来检测药物对于细胞转移能力的作用变化;间接荧光标记法测定经过不同浓度的青藤碱作用后,细胞内活性氧水平的变化;利用酶抑制动力学方法,研究青藤碱对逆转录酶的抑制作用;再通过逆转录聚合酶链式反应和蛋白质印迹的实验来检测Hep G2细胞中凋亡蛋白水平的变化。结果:青藤碱对Hep G2人肝癌细胞株具有抗侵袭及转移的治疗作用。MTT检测结果显示青藤碱对于Hep G2人肝癌细胞抗增殖作用明显,半抑制浓度IC50为(15.35±2.43)μmol/L;而Transwell法的结果显示青藤碱对癌细胞有较好的抗转移能力;青藤碱是一种有效的逆转录酶抑制剂,IC50为(21.32±2.43)μmol/L;荧光标记法检测细胞内活性氧水平随青藤碱呈浓度依赖性升高;蛋白水平测定显示青藤碱上调Hep G2人肝癌细胞CASP3、CASP9、CAV1和下调SOX2的表达。结论:青藤碱可能是通过上调CASP3、CASP9、CAV1和下调SOX2的表达,进而抑制人肝癌细胞的增殖和转移,调节相关信号通路,最终在分子水平证明青藤碱对Hep G2人肝癌细胞的抑制作用。

针刺、神经生长因子对脑瘫幼鼠智力及脑海马细胞凋亡基因的影响

目的：观察针刺和神经生长因子（NGF）对脑瘫模型幼鼠智力恢复以及脑海马组织BCL-2、BAX、Casp3基因mRNA表达的影响。方法：采用缺血缺氧（HIBD）的方法制备幼鼠脑瘫的模型，幼鼠出生后7d称重、实验分组、造模。实验分为5组：正常组、假手术组、模型组、单纯针刺组、针刺＋NGF组。术后3～15d按计划给予相应干预。术后18d取材，用荧光定量PCR（SYBRGreenI染料法）检测其脑海马组织BCL-2、BAX、Casp3基因mRNA表达：用TUNEL法检测其脑皮质神经细胞凋亡情况。结果：与模型组相比，单纯针刺组和针刺＋NGF组幼鼠的脑细胞抗凋亡BCL-2基因mRNA表达A值均数更高；BAX、Casp3基因mRNA表达A值均数更低：脑皮质组织细胞凋亡指数均数更低，且针刺＋NGF组凋亡指数比单纯针刺组更低。结论：在抗脑神经细胞凋亡方面．针刺对HIBD幼鼠都有明显的治疗作用，加用NGF后效果更好。

四妙散调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎大鼠的实验研究

目的:通过膝骨关节炎大鼠模型研究四妙散调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎(KOA)大鼠的作用机制。方法:8周龄SD大鼠27只,随机分为正常对照组、KOA模型组、四妙散组,KOA模型组和四妙散组采用前交叉韧带切除法制作KOA模型,手术6周后四妙散组以四妙散药液灌胃,正常对照组和KOA模型组以生理盐水灌胃。连续灌胃4周后取膝关节软骨组织,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定凋亡细胞所占比例,采用荧光定量PCR检测关节软骨组织中凋亡和自噬相关基因表达水平。结果:与正常对照组比较,KOA模型组大鼠关节软骨细胞凋亡率显著升高,关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Fadd、Casp3的表达显著升高,自噬相关蛋白LC3的表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与KOA模型组比较,四妙散组大鼠关节软骨细胞凋亡率显著降低,关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Fadd、Casp3的表达显著降低,自噬相关蛋白LC3的表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:软骨细胞凋亡是KOA发病中的重要因素,该凋亡可能通过FADD-CASP3途径发挥作用。软骨细胞自噬作用的激活可抑制细胞凋亡,可能是延缓及控制KOA进展的一个新机制,四妙散可能通过该机制发挥治疗作用。

基于GEO数据库分析前列腺癌生化复发相关基因及通路

目的:本研究旨在发现影响前列腺癌根治性切除术后复发的潜在基因,为预测前列腺癌患者预后的方法提供新的可能。方法:从基因芯片公共数据库(GEO)下载GSE25136微阵列数据集,包括39例复发性前列腺癌和40例非复发性前列腺癌样本。利用Limma包识别差异表达基因,利用Pheatmap包进行表达层次聚类分析筛选差异表达基因。通过Cytoscape软件的ClueGO模块进行基因本体功能富集分析预测了差异化基因的潜在功能。利用String网站在Cytoscape软件中构建了差异基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,并使用CytoHubba进行模块分析,以了解这些差异基因之间的相互作用,并找出蛋白网络的关键基因。采用免疫组化染色的方法在前列腺癌及正常前列腺组织中进行验证。结果:复发性前列腺癌与非复发性前列腺癌的样本相比,共发现上调的差异基因167个,下调的差异基因91个(P≤0.05)。分别选取了上调、下调中表达显著的前50个基因,主要涉及的GO富集途径有大脑边缘系统的发育、干扰素-γ介导的信号通路等。并发现CASP3和STAT1为蛋白网络的关键基因,免疫组织化学染色验证了这2个关键基因在前列腺癌及前列腺增生组织中的差异表达。结论:非复发性前列腺癌向复发性前列腺癌进展的过程显示出强大的基因特征。大脑边缘系统的发育和干扰素-γ介导的信号通路与复发性前列腺癌的发生发展密切相关。此外,基因CASP3和STAT1作为关键基因可能在复发性前列腺癌的诊断和治疗中发挥重要作用。

紫檀芪对视网膜色素上皮细胞的保护作用

[目的]探讨紫檀芪对视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用机制.[方法]建立蓝光诱导负载N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)光损伤模型.利用MTT比色法检测紫檀芪(0.625、1.250、2.500、5.000μmol/L)对ARPE-19细胞的毒性;通过倒置显微镜观察紫檀芪对ARPE-19细胞损伤的影响;采用RT-qPCR法检测ARPE-19细胞凋亡相关基因CASP3和PARP1的表达水平.[结果]紫檀芪在5.000μmol/L浓度下对细胞无明显毒性,对蓝光负载A2E导致的ARPE-19细胞损伤及其CASP3和PARP1基因的表达具有显著的抑制作用(P<0.05,P<0.01).[结论]紫檀芪可通过抑制CASP3和PARP1基因的表达而发挥对ARPE-19细胞损伤的保护作用.

异土木香内酯诱导慢性粒细胞白血病细胞BCR-ABL融合蛋白降解

目的·探索异土木香内酯(isoalantolactone,Iso)对伊马替尼敏感和耐药的慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞的效应,以及下调BCR-ABL融合蛋白的分子机制。方法·采用不同浓度的Iso分别处理K562和K562R细胞0、24、36、48 h后,用CCK-8法测定Iso对CML细胞的抑制效应。用流式细胞术检测Iso诱导K562和K562R细胞24 h的凋亡效应。蛋白质印迹法(Western blotting)检测不同浓度、不同作用时间下Iso对CML细胞中BCR-ABL融合蛋白水平的影响。采用反转录及实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测Iso对CML细胞中BCR-ABL mRNA水平的影响。分别用蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和溶酶体抑制剂氯喹联合Iso处理K562细胞,用半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK联合Iso处理K562与K562R细胞,并采用Western blotting检测BCR-ABL融合蛋白水平的改变。在K562R细胞中敲减半胱天冬酶3(caspase 3,CASP3)、半胱天冬酶7(caspase 7,CASP7),检测其对由Iso诱导BCR-ABL融合蛋白下调的影响。结果·Iso抑制CML细胞的增殖,且呈剂量和时间依赖性。流式细胞术结果显示Iso可增加K562与K562R细胞凋亡的发生(均P<0.05)。Western blotting结果显示Iso能诱导BCR-ABL融合蛋白水平降低,而qPCR结果显示BCR-ABL mRNA水平无显著变化。MG132、3-甲基腺嘌呤以及氯喹不能逆转由Iso诱导的BCR-ABL融合蛋白的下调,而Z-VAD-FMK可部分逆转该下调。敲减CASP3后能部分逆转由Iso诱导的BCR-ABL蛋白的降解,而CASP7敲减后则无影响。结论·Iso可靶向降解BCR-ABL融合蛋白。该结果为克服CML细胞的耐药提供了实验基础。

基于网络药理学及实验验证探究环丙沙星加重主动脉夹层的潜在致病机制

目的 通过网络药理学及分子对接技术,筛选环丙沙星调控主动脉夹层发生发展的关键靶点基因,并通过动物及细胞实验进一步探究其潜在致病机制。方法 通过TargetPrediction、PharmMapper、GeneCards、CTD数据库分别筛选环丙沙星及主动脉夹层的相关靶点,二者取交集后得到环丙沙星调控主动脉夹层的潜在靶点;使用基因与蛋白质相互作用检索数据库(STRING)构建蛋白质相互作用(PPI)网络分析潜在靶点间的关联。通过对潜在靶点进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析和基因本体(GO)功能富集分析,构建“药物–靶点–通路–疾病”网络。利用Cytoscape软件及蛋白质复合物聚类算法(MCODE)等插件进一步筛选出关键靶点,通过AutoDock vina和PyMol软件把环丙沙星化学结构与筛选出的关键靶点进行分子对接及可视化呈现。最后结合动物模型构建、苏木精–伊红(HE)染色法、细胞增殖和毒性检测实验、体内外实时荧光定量反应(RT-qPCR)实验及蛋白质免疫印迹(Western blotting),检测小鼠主动脉组织及人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)关键靶点基因表达。结果 本研究筛选出515个环丙沙星相关靶点,9 004个主动脉夹层相关靶点,并得到412个环丙沙星介导主动脉夹层的潜在靶点。KEGG通路富集分析结果显示,主要富集于血脂与动脉粥样硬化、白细胞介素(IL)-17信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等。GO功能富集分析结果显示,细胞定位(CC)主要富集于膜筏、膜微区等;分子功能(MF)主要富集于受体结合、异生物跨膜转运蛋白活性等;生物学过程(BP)主要富集于对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应等。STRING及Cytoscape分析构建PPI网络图及关键子模块,获得了15个关键靶点,分别为B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、转录因子AP-1(JUN)、CD44、胱天蛋白酶3(CASP3)、Toll样受体4(TLR4)、γ干扰素(IFNG)、肿瘤蛋白P53(TP53)、蛋白激酶B1(Akt1)、白蛋白(ALB)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、白细胞介素(IL)-6、IL-10、IL-1β、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肿瘤坏死因子(TNF)。分子对接结果显示,环丙沙星与MMP9、ALB、GAPDH、Akt1、TP53、CASP3、IL-1β的对接模式较好。体内实验表明,相较于模型组,模型+环丙沙星组在成膜率和死亡率上均增加,管壁弹性结构破坏也更加严重;促凋亡基因及促炎基因的m RNA表达水平及蛋白表达水平均增加。体外实验发现,相较于对照组,不同浓度环丙沙星刺激HASMCs细胞后,MMP9、IL-6、CASP3、JUN、IL-1β、TP53和TLR4表达水平明显上调,Akt1表达水平明显下调。结论 环丙沙星是介导主动脉夹层发生发展的重要因素之一,可能通过刺激炎症因子表达及VASMCs凋亡发挥调控作用。

基于网络药理学及分子对接探讨尿石素A治疗结肠癌的作用机制

目的 通过网络药理学及分子对接探究尿石素A治疗结肠癌的主要生物过程和信号通路,阐明其作用机制。方法 通过SwissTargetPrediction、Targets SUP-PRED和Cbligand等数据库预测尿石素A药物潜在作用靶点,检索DisGeNET、OMIM、GeneCards等数据库获得结肠癌相疾病靶点;通过Venn图获得相关交集靶点。运用STRING数据库构建交集靶点的蛋白相互作用(PPI)网络;使用Cytoscape软件对STRING数据库筛选的靶点进行网络拓扑分析筛选关键靶点;运用David数据库对交集靶点进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析,最后通过分子对接明确尿石素A治疗结肠癌的作用机制。结果 预测得到尿石素A靶点260个,筛选、去重得到结肠癌疾病靶点3 289个,最后得到交集靶点106个。核心靶点21个,得到蛋白激酶B1(Akt1)、表皮生长因子受体(EGFR)、胱天蛋白酶3(CASP3)、雌激素受体1(ESR1)、环加氧酶2(PTGS2)等10个核心靶点。GO和KEGG分析表示,尿石素A可能通过癌症通路、癌症相关蛋白聚糖通路等治疗结肠癌的作用。分子对接结果显示尿石素A与核心靶点对接结合能均小于-6.9 kcal/mol。结论 尿石素A可通过多靶点和多通路的途径发挥治疗结肠癌的功效。