重组Caspase-3基因的构建及其诱导胰腺癌细胞凋亡的观察

通过对 Caspase- 3(半胱氨酸蛋白酶 3)大亚基 (L S) ,小亚基 (SS)的重组 ,构建重组型 Caspase- 3基因 (r-caspase- 3) ,并探讨 r- Caspase- 3基因诱导胰腺癌细胞凋亡的可能性 ,以寻求肿瘤基因治疗的新途径。采用分子生物学方法克隆 Caspase- 3的大、小亚基 ,体外进行重新排列组合 ,使大、小亚基原来的排序颠倒 ,构建出 pc DNA3.1(+) / r- Caspase- 3真核表达质粒 ;利用脂质体瞬时转染人胰腺癌细胞 PC- ,RT- PCR检测 r- Caspase- 3m RNA的表达 ;流式细胞技术 (FCM)检测转染胰腺癌细胞凋亡状况。结果显示 :Caspase- 3的大、小亚基被完整克隆 ,r- Cas-pase- 3基因测序结果证实小亚基位于大亚基之前 ;RT- PCR扩增出 894 bp大小片段 ,流式细胞检测可见明显的凋亡峰出现。以上结果表明 ,重组 r- Caspase- 3基因其 m RNA可在胰腺癌细胞中表达并自催化诱导细胞凋亡 。

重组型Caspase-3基因的构建及其在胰腺癌细胞中凋亡活性的观察

目的 通过对半胱氨酸蛋白酶 3 (Caspase 3 )大、小亚基的重组 ,构建pcDNA3 .1(+ ) /r Caspase 3真核表达质粒 ,并探讨r Caspase 3基因诱导细胞凋亡的可能性 ,以寻求肿瘤基因治疗的新途径。 方法 采用分子生物学方法克隆Caspase 3的大、小亚基 ,并在体外进行重新排列组合 ,使大、小亚基原来的排序颠倒 ,构建出pcDNA3 .1(+ ) /r Caspase 3真核表达质粒 ;脂质体瞬时转染人胰腺癌细胞PC Ⅱ ,RT PCR检测r Caspase 3mRNA的表达 ;流式细胞技术 (FCM )检测转染胰腺癌细胞凋亡状况。结果 Caspase 3的大、小亚基被完整克隆 ,pcDNA3 .1(+ ) /r Caspase 3真核表达质粒测序结果证实小亚基位于大亚基之前 ;RT PCR扩增出 894bp大小片段 ,流式细胞检测可见明显的凋亡峰出现。 结论 构建的r Caspase 3其mRNA可在胰腺癌细胞中表达并自催化诱导细胞凋亡 ,可作为胰腺癌基因治疗的目的基因。

低表达bcl-2对神经酰胺诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的观察无血清条件下bcl2对神经酰胺诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的影响。方法通过脂质体介导的基因转染,建立稳定转染表达反义bcl2mRNA的cDNA片段的真核表达质粒的人肝癌细胞HepG2(HepG2antibcl2)并鉴定,采用AOEB荧光染色、流式细胞术DNA倍体分析和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,分光光度法测定Caspase3活性。结果终浓度50μmol/LC2神经酰胺作用24h,可诱导无血清培养的HepG2细胞、HepG2vector细胞及HepG2antibcl2细胞发生凋亡。AOEB染色可见典型的细胞凋亡表现。流式细胞仪检测显示C2神经酰胺作用12,18,24h,HepG2antibcl2细胞凋亡率较同时间HepG2细胞及HepG2vector细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。终浓度50μmol/LC2神经酰胺作用12h,HepG2antibcl2细胞DNA凝胶电泳呈现梯状条带,而HepG2细胞及HepG2vector细胞作用24h出现DNA梯状条带。HepG2细胞和HepG2vector细胞Caspase3活性随C2神经酰胺(50μmol/L)作用时间延长而增强,HepG2antibcl2细胞Caspase3活性始终维持较高水平。结论低表达bcl2可通过增加Caspase3活性从而促进C2神经酰胺诱导的HepG2细胞凋亡。