基于网络药理学和动物实验探讨黄连解毒汤通过Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路抗结直肠腺瘤作用机制

目的:研究黄连解毒汤通过调控Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路发挥抗结直肠腺瘤(CRA)的作用机制。方法:通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)获取黄连解毒汤的活性成分及作用靶点;通过在线人类孟德尔遗传病数据库(OMIM)和人类基因组数据库(GeneCard)获取CRA疾病靶点;通过Venny 2.1软件获得黄连解毒汤与CRA的交集靶点;通过String数据库和Cytoscape 3.9.1软件绘制蛋白互作网络,并筛选黄连解毒汤治疗CRA的核心作用靶点;通过DAVID数据库对交集靶点进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析;通过Auto Dock Tools 1.5.6软件将前5位药物活性成分与前5位关键靶点进行分子对接验证。采用随机数字表法将60只小鼠分为正常组、模型组、黄连解毒汤低剂量组、黄连解毒汤中剂量组、黄连解毒汤高剂量组、阿司匹林组,每组10只。采用氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)联合诱导小鼠CRA模型,同时各组予相应药物进行灌胃干预9周。苏木精-伊红染色法(HE)观察小鼠肠组织的病理变化;原位末端转移酶标记法(TUNEL)观察肠组织细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链式反应(Realtime PCR)检测腺瘤组织B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)mRNA、Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA、细胞色素C(Cyt C)mRNA、胱天蛋白酶-9(Caspase-9)mRNA、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blotting)法检测腺瘤组织Bcl-2、Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表达水平。结果:网络药理学共筛选得到黄连解毒汤80个活性成分,药物-疾病交集靶点170个;通过药物-成分-靶点-疾病调控网络的构建,筛选出槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、黄连素(berberine)、汉黄芩素(wogonin)等核心活性成分;通过构建蛋白互作网络,筛选出AKT1、JUN、HSP90AA1、CASP3、IL-6等关键靶点;GO与KEGG富集分析发现黄连解毒汤可能通过调控细胞凋亡途径发挥治疗CRA的作用;槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、黄连素、汉黄芩素与核心靶点AKT1、JUN、HSP90AA1、CASP3、IL-6具有较为稳定的结合活性,展现了良好的亲和力。动物实验结果显示,模型组小鼠肠道质量、腺瘤数量高于正常组(P<0.01),结直肠长度低于正常组(P<0.01);黄连解毒汤高、中、低剂量组小鼠肠道质量、腺瘤数量均低于模型组(P<0.01);黄连解毒汤高、中剂量组小鼠结直肠长度均高于模型组(P<0.01)。模型组小鼠腺瘤组织细胞凋亡率低于正常组(P<0.01);黄连解毒汤低、中、高剂量组小鼠腺瘤组织细胞凋亡率均高于模型组(P<0.01)。模型组小鼠腺瘤组织Bcl-2 mRNA和Bcl-2蛋白相对表达量高于正常组(P<0.01),Bax mRNA、Cyt C mRNA、Caspase-9 mRNA、Caspase-3 mRNA和Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3蛋白相对表达量低于正常组(P<0.01或P<0.05)。黄连解毒汤高、中剂量组小鼠腺瘤组织Bcl-2 mRNA及Bcl-2蛋白相对表达量均低于模型组(P<0.01),Bax mRNA、Cyt C mRNA、Caspase-9 mRNA、Caspase-3 mRNA及Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3蛋白相对表达量均高于模型组(P<0.05或P<0.01);黄连解毒汤低剂量组小鼠Caspase-9 mRNA及Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白相对表达量高于模型组(P<0.05或P<0.01)。结论:黄连解毒汤可能通过调控Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路发挥治疗CRA的效应。

β-紫罗兰酮通过Caspase-3信号通路对乳腺癌细胞生物学行为的调控作用

目的研究β-紫罗兰酮通过Caspase-3信号对乳腺癌细胞生物学行为的调控作用。方法将人乳腺癌MCF-7细胞分为空白对照组与实验组,实验组按照β-紫罗兰酮的不同浓度,又分为25μmol/L组、50μmol/L组、100μmol/L组及200μmol/L组。分别采用CCK-8及台盼蓝计数法检测β-紫罗兰酮对MCF-7细胞增殖及生长曲线的影响,Hoechst 33258荧光染色法观察β-紫罗兰酮对MCF-7细胞凋亡形态的影响,RT-PCR及Western Blot法检测β-紫罗兰酮对Caspase-3 mRNA及蛋白表达的影响。结果与空白对照组相比,经不同浓度β-紫罗兰酮处理后的乳腺癌MCF-7细胞OD值均显著下降(P<0.05),实验组中经β-紫罗兰酮浓度25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L处理后的MCF-7细胞增殖抑制率分别为7.92%、28.96%、45.22%和56.83%。不同浓度β-紫罗兰酮处理过的MCF-7细胞从第2天开始,较空白对照组的细胞计数显著降低(P<0.05),空白组对照组及β-紫罗兰酮浓度为25μmol/L组MCF-7细胞计数在7 d内随时间迁移呈上升趋势,经β-紫罗兰酮浓度为50、100及200μmol/L处理后的MCF-7细胞7 d内细胞计数呈下降趋势。Hoechst 33258荧光染色法检测发现,与空白对照组相比,给予β-紫罗兰酮处理过的人乳腺癌MCF-7细胞伴有不同程度的凋亡现象,而经β-紫罗兰酮浓度为200μmol/L处理后的细胞凋亡现象最明显。与空白对照组相比,经不同浓度β-紫罗兰酮处理过的MCF-7细胞Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平均显著上升(P<0.05),且随β-紫罗兰酮浓度的升高,其Caspase-3 mRNA及蛋白表达呈上升趋势(P<0.05)。结论β-紫罗兰酮可能通过激活Caspase-3信号通路,抑制乳腺癌细胞增殖与生长,促进其凋亡,发挥抑癌作用。

黄芪甲苷通过Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的机制研究

目的观察黄芪甲苷(Astragaloside-IV,AS)抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖及诱导凋亡作用,并探讨其Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路作用机制。方法将MCF-7细胞分为空白对照组(AS,0μmol·L-1)和黄芪甲苷50、25、12.5μmol·L-1浓度组。采用CCK-8和台盼蓝计数法检测黄芪甲苷对MCF-7细胞增殖和生长曲线的影响;采用Hoechst 33258荧光染色法观察黄芪甲苷对MCF-7细胞凋亡形态学的影响;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blot法分析黄芪甲苷对MCF-7细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3 mRNA及蛋白表达的影响。结果与空白对照组比较,黄芪甲苷25、50μmol·L-1组MCF-7细胞增殖明显被抑制(P<0.01),生长曲线(2~7 d)显著减缓(P<0.05,P<0.01),细胞凋亡明显增多;RT-PCR和Western Blot试验结果发现黄芪甲苷25、50μmol·L-1组MCF-7细胞Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.01),Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.01),Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显下调(P<0.01)。结论黄芪甲苷可抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,诱导其凋亡,其作用机制可能与调控Bax/Bcl-2/Caspase-3凋亡信号通路有关。

芦荟大黄素通过Bax/Caspase-3信号通路调控肝癌细胞自噬作用研究

目的:探讨芦荟大黄素通过B淋巴细胞癌-2基因(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)信号通路调控肝癌细胞自噬的作用。方法:选用肝癌SMMC-7721细胞,设置SMMC-7721组、5氟尿嘧啶组、芦荟大黄素低、高剂量组(低、高剂量组)。5氟尿嘧啶组加入5氟尿嘧啶至终浓度为80μg/mL,低、高剂量组加入芦荟大黄素至终浓度分别为100μg/mL、200μg/mL。以上各组每孔设6个平行样,培养72 h。试验结束后,采用MTT法测定细胞增殖水平,吖啶橙染色观察细胞自噬水平,流式细胞仪测定细胞凋亡水平,RT-PCR法及Western-blot法测定细胞Bax、Caspase-3基因和蛋白水平。结果:与SMMC-7721组比较,其余各组细胞存活率降低(P<0.05),自噬小体、凋亡率、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05);与低剂量组比较,高剂量组存活率降低(P<0.05),自噬小体、凋亡率、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平升高(P<0.05);与5氟尿嘧啶组比较,低、高剂量组细胞存活率升高(P<0.05),自噬小体、凋亡率、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:芦荟大黄素能明显抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖,诱导该细胞发生自噬和凋亡,且其机制与芦荟大黄素能促进Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达有关。

鲜地黄中两个酰胺类化合物通过SIRT3/Bcl-2/Caspase-3信号通路减轻LPS诱导的NRK-52e细胞损伤

目的:探究鲜地黄中两个酰胺类化合物rehmagluamide(Reh)和rehmanalkaloid C(Reh C)对LPS诱导NRK-52e细胞损伤的干预作用及潜在机制。方法:建立LPS诱导的NRK-52e细胞损伤模型,加入SIRT3选择性抑制剂3-TYP,ELISA法检测细胞上清液中炎症因子TNF-α与IL-6水平;流式细胞术检测细胞凋亡、活性氧(ROS)与线粒体膜电位(JC-1)水平;细胞免疫荧光检测细胞中SIRT3蛋白及线粒体凋亡关键蛋白Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2表达。结果:与模型组比较,Reh和Reh C可不同程度降低LPS作用下NRK-52e细胞凋亡及TNF-α、IL-6、ROS水平和Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达,升高线粒体膜电位、SIRT3蛋白表达及Bcl-2/Bax水平,但在加入3-TYP后Reh和Reh C的改善作用显著降低。结论:Reh和Reh C可能通过SIRT3/Bcl-2/Caspase-3信号通路减轻LPS诱导的NRK-52e细胞损伤。

澳洲茄碱通过调控Bcl-2/Bax/caspase-3信号通路促进非小细胞肺癌发生凋亡

目的 探讨龙葵活性成分澳洲茄碱对非小细胞肺癌细胞PC9增殖、凋亡的影响。方法 体外培养PC9细胞,设对照组(0μmol/L)及澳洲茄碱不同剂量组(0、2、5、10、15、20、25μmol/L),CCK-8试剂盒检测澳洲茄碱对PC9细胞的增殖抑制作用;TMRE检测线粒膜电位;caspase3/7活性试剂盒联合GreenNuc?Caspase-3/Annexin V-mCherry染色检测caspase-3活性;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;给药处理或者使用PTEN抑制剂后,Western blot检测细胞中相关蛋白的表达量。结果 与对照组相比,经澳洲茄碱干预24、48、72 h后,PC9细胞的活力均明显降低(P<0.05);经澳洲茄碱干预24 h后,细胞线粒体膜电位明显降低,而细胞凋亡比例明显升高(P<0.05);caspase-3/7活力、活细胞Caspase-3活性及cleaved caspase-3蛋白表达均显著升高(P<0.01);PI3K和Akt磷酸化水平降低(P<0.05);而PTEN、Bax蛋白表达上调(P<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达下调(P<0.05)。结论 澳洲茄碱可通过调控Bcl-2/Bax/caspase-3通路及其上游蛋白活性而抑制PC9细胞增殖,促进其凋亡。

沙库巴曲缬沙坦钠通过Bax/caspase-3信号通路抑制心肌细胞凋亡

为了探索沙库巴曲缬沙坦钠(LCZ696)抑制心衰心肌细胞凋亡的作用机制,腹腔注射盐酸阿霉素构建SD大鼠心衰模型,模型构建成功后随机分为心衰组(HF)、缬沙坦组(Val)、LCZ696低剂量组(LCZ-L)、LCZ696高剂量组(LCZ-H),空白组(Control),治疗8周后观察大鼠平均动脉压(MAP)、体质量、心率(HR)变化,检测血清中脑钠肽(BNP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸肌酶(CK)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)含量,超声评价各组大鼠心功能改善情况;将大鼠左心室心肌组织进行HE染色和Tunel染色;检测活化的AKT(P-AKT)、Bax、caspase-3蛋白表达.结果显示:心衰大鼠经Val及LCZ696治疗后超声显示心脏功能均有明显改善,BNP、CK-MB、CK、AST、ALT水平下降,其中LCZ-H组降低最明显;HE染色及Tunel染色显示经治疗后细胞凋亡数减少,心肌组织中P-AKT含量较HF增加,Bax、caspase-3蛋白含量较HF组降低,LCZ-H组减少最显著.综上可知,LCZ696通过抑制Bax/caspase-3信号通路抑制心肌细胞凋亡,改善心功能.

核心钟基因Bmal1通过JNK/caspase-3信号通路抑制缺血再灌注损伤PC12细胞的炎症及凋亡

目的:探讨核心钟基因Bmal1(brain and muscle Arnt-like 1)对脑缺血再灌注损伤后细胞炎症反应及凋亡的影响。方法:通过慢病毒转染建立Bmal1基因沉默(si-Bmal1)及阴性对照(si-NC)的稳定大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株,将细胞分为空白(blank)组、氧糖剥夺/复氧(OGD/R)组、OGD/R+si-NC组及OGD/R+si-Bmal1组。通过OGD/R诱导建立脑缺血再灌注损伤体外模型,CCK-8法检测沉默Bmal1基因对细胞活力及OGD/R后细胞活力的影响;Western blot法检测Bmal1、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)及cleaved caspase-3蛋白水平;RT-qPCR法检测Bmal1、JNK及caspase-3的mRNA表达水平;ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;流式细胞术及TUNEL染色法检测各组细胞凋亡率;免疫荧光检测JNK核内表达情况。结果:沉默Bmal1基因使PC12细胞活力及OGD/R后PC12细胞活力均显著下降(P<0.05或P<0.01)。沉默Bmal1基因可进一步促进OGD/R后JNK/caspase-3通路相关分子的mRNA及蛋白表达(P<0.05或P<0.01),增加细胞上清液中炎症因子IL-6和TNF-α水平及细胞凋亡率(P<0.05或P<0.01),促进JNK核内表达。结论:核心钟基因Bmal1抑制缺血再灌注损伤PC12细胞的炎症反应及凋亡,其机制可能与JNK/caspase-3信号通路有关。

制冰片介导Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路改善心肌细胞H/R损伤

目的研究天竺黄制冰片对缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用及潜在作用机制。方法通过给予H9C2心肌细胞不同的缺氧时间体外模拟缺血再灌注损伤,测定损伤后H9C2心肌细胞中超氧化物歧化酶(superioxide diamutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogense,LDH)水平,评估模型是否成功建立。MTT方法测定天竺黄、冰片及制冰片对H9C2细胞的安全浓度范围,并检测天竺黄、冰片及制冰片对H/R诱导后心肌细胞中MDA、SOD和LDH生成的影响。采用Real-time PCR和Western blot方法检测天竺黄制冰片对H/R诱导H9C2细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3基因和蛋白的表达。结果缺氧6 h,复氧4 h,心肌细胞存活率小于50%,细胞中MDA和LDH水平显著增加,SOD活性显著降低,成功模拟缺血再灌注模型。天竺黄、冰片及制冰片在12.5~100μg/mL浓度范围内,对心肌细胞活力均没有影响。天竺黄(6.25~100μg/mL)对H/R诱导的H9C2细胞活力没有显著影响;冰片(25~100μg/mL)显著增加H/R诱导的H9C2细胞活力(P<0.05),制冰片(25~100μg/mL)极显著增加了H/R诱导的H9C2细胞活力(P<0.01)。同时,与模型组相比,冰片和制冰片分别给药均降低了H/R诱导的心肌细胞中MDA和LDH的水平,提高了SOD的活性,且同浓度制冰片调节作用优于冰片。同时,天竺黄制冰片通过上调了Bcl-2基因和蛋白表达,下调Bax、Caspase-3基因和蛋白表达,发挥抑制细胞凋亡的作用。结论天竺黄制冰片可通过调控Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路阻碍心肌细胞凋亡,进而达到保护心肌的作用。

复方蛇龙胶囊抑制Bax/Caspase-3信号通路减轻膜性肾病大鼠肾组织细胞凋亡的研究

目的 探讨复方蛇龙胶囊抑制Bax/Caspase-3信号通路减轻膜性肾病大鼠肾组织细胞凋亡的影响。方法 抽取10只6周龄SPF级雄性SD大鼠作为正常组,其余40只采用注射阳离子化牛血清白蛋白(Alb)构建膜性肾病大鼠模型,采用随机数字表法将其分为模型组,雷公藤多苷片组,复方蛇龙胶囊低、高剂量组,每组10只。除正常组和模型组灌服等量生理盐水外,其余各组灌胃给予相应药物,连续4周。HE染色、Masson染色、透射电镜及扫描电镜观察各组肾组织病理学变化;比较各组大鼠尿微量白蛋白(mAlb)和血肌酐(SCr)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、Alb、总蛋白(TP)含量;比较各组大鼠肾组织细胞凋亡率;比较各组大鼠肾组织Nephrin、Podocin、Bcl-2、Bax和Caspase-3 m RNA表达水平。结果 与正常组比较,模型组大鼠尿m Alb含量升高(P<0.05);血清Alb、TP含量降低,TC、TG和SCr含量升高(P<0.05)。与模型组比较,复方蛇龙胶囊低、高剂量组大鼠尿m Alb含量降低(P<0.05);血清Alb、TP含量升高,TC、TG和SCr含量降低(P<0.05)。与复方蛇龙胶囊低剂量组比较,复方蛇龙胶囊高剂量组尿m Alb降低(P<0.05);血清Alb、TP含量升高,SCr含量降低(P<0.05)。正常组大鼠HE染色可见肾小球结构完整;Masson染色未见组织纤维化。模型组大鼠HE染色可见肾小球体积增大,肾小管可见空泡变性,并伴有蛋白管型;Masson染色可见组织纤维化,蓝色胶原纤维组织出现。与模型组比较,复方蛇龙胶囊低、高剂量组大鼠肾小球体积增大、肾小管空泡变性及组织纤维化有所减轻。正常组基底膜结构完整,足细胞结构正常;模型组肾小球大面积水肿,基底膜增厚,足突融合变宽,足细胞结构严重损伤,细胞骨架蛋白裸露;与模型组比较,复方蛇龙胶囊低、高剂量组大鼠基底膜增厚程度减轻,足细胞形态结构趋于正常。与正常组比较,模型组大鼠肾组织细胞凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较,复方蛇龙胶囊低、高剂量组大鼠肾组织细胞凋亡率降低(P<0.05);与复方蛇龙胶囊低剂量组比较,复方蛇龙胶囊高剂量组大鼠肾组织细胞凋亡率降低(P<0.05)。与正常组比较,模型组大鼠Nephrin、Podocin、Bcl-2 m RNA表达水平降低,Caspase-3、Bax m RNA表达水平升高,Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)。与模型组比较,复方蛇龙胶囊低、高剂量组大鼠Nephrin、Podocin、Bcl-2 m RNA表达水平升高,Caspase-3、Bax m RNA表达水平降低,Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。与复方蛇龙胶囊低剂量组比较,复方蛇龙胶囊高剂量组Nephrin、Podocin m RNA表达水平升高,Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。结论 复方蛇龙胶囊能有效改善膜性肾病大鼠蛋白尿,显著减轻肾脏病理损伤,延缓膜性肾病进展,其机制可能与抑制足细胞凋亡有关。

绞股蓝总皂苷对光老化人皮肤成纤维细胞Caspase-3信号通路的影响

目的观察绞股蓝总皂苷(Gyp)含药血清对光老化人皮肤成纤维细胞(HSF细胞)凋亡现象及Caspase-3信号通路的影响。方法 HSF细胞分为:空白对照组、长波紫外线(UVA)模型组、正常血清干预组、低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组和高剂量含药血清干预组。采用二氯荧光素(DCF)法检测UVA诱导的细胞活性氧表达;采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测各组HSF细胞活性;采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blotting方法,分别检测各组HSF细胞Caspase-3基因和蛋白表达。结果与空白对照组比较,UVA模型组、正常血清干预组、低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组HSF细胞活性氧(平均荧光强度)及活性氧水平升高、OD值降低、Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01);与UVA模型组和正常血清干预组比较,低剂量含药血清干预组、中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组HSF细胞活性氧(平均荧光强度)及活性氧水平降低,Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平降低,中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组OD值升高(P<0.01);与低剂量含药血清干预组比较,中剂量含药血清干预组、高剂量含药血清干预组Caspase-3 mRNA表达水平降低(P<0.01);与中剂量含药血清干预组比较,高剂量含药血清干预组Caspase-3 mRNA表达水平降低(P<0.01);与低剂量含药血清干预组和中剂量含药血清干预组比较,高剂量含药血清干预组Caspase-3表达水平降低(P<0.01)。结论 Gyp含药血清可以帮助HSF细胞增强对UVA照射引起的光老化损伤的抵御能力,能够缓解HSF细胞光老化现象,其作用机制包括有效抑制细胞内活性氧产生和抑制Caspase-3信号通路的激活,使光老化细胞凋亡数目显著下降。Gyp对光老化HSF细胞的药理作用与减轻及修复HSF细胞光老化中DNA所受的损伤有关。

黄夏白冬消癌汤对Lewis肺癌小鼠Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路的影响

目的观察黄夏白冬消癌汤对Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路的影响。方法选取40只雄性C57BL/6小鼠,于小鼠右侧腋窝皮下注射Lewis肺癌细胞悬液建立肺癌模型。将造模成功的Lewis肺癌小鼠随机分为4组,每组10只。模型组给予生理盐水灌胃(1次/d),顺铂组给予顺铂2 mg/kg腹腔注射(每2 d 1次),黄夏白冬消癌汤低、高剂量组分别给予2 g/mL和4 g/mL黄夏白冬消癌汤灌胃(1次/d),均连续干预14 d。测量各组干预2,4,6,8,10,12,14 d后肿瘤长径与短径,计算肿瘤体积;干预结束后脱颈椎处死小鼠,称瘤重,计算抑瘤率;取各组小鼠瘤组织,采用Western blot法检测瘤组织中NF-κBp65、p-NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleved-Caspase-3蛋白表达情况,采用qPCR法检测瘤组织中NF-κB p65、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相对表达量。结果黄夏白冬消癌汤低剂量组干预6~14 d期间各时间点肿瘤体积及干预结束后瘤重与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);顺铂组及黄夏白冬消癌汤高剂量组肿瘤生长延缓,各时间点肿瘤体积及干预结束后瘤重均明显低于模型组(P均<0.05),抑瘤率均明显高于黄夏白冬消癌汤低剂量组(P均<0.05),顺铂组与黄夏白冬消癌汤高剂量组各时间点肿瘤体积、干预结束后瘤重、抑瘤率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。顺铂组及黄夏白冬消癌汤低、高剂量组p-NF-κB p65/NF-κB p65及NF-κB p65、Bcl-2 mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),Cleved-Caspase-3/Caspase-3均明显高于模型组(P均<0.05);顺铂组及黄夏白冬消癌汤高剂量组Bax/Bcl-2及Bax、Caspase-3 mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05),黄夏白冬消癌汤低剂量组与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);黄夏白冬消癌汤低、高剂量组p-NF-κB p65/NF-κB p65及Bcl-2 mRNA相对表达量均明显高于顺铂组(P均<0.05),Cleved-Caspase-3/Caspase-3及Bax、Caspase-3 mRNA相对表达量均明显低于顺铂组(P均<0.05),NF-κB p65 mRNA相对表达量与顺铂组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);黄夏白冬消癌汤高剂量组Bax/Bcl-2与顺铂组比较差异无统计学意义(P>0.05),黄夏白冬消癌汤低剂量组明显低于顺铂组(P<0.05)。结论黄夏白冬消癌汤可以通过上调Bax、Caspase-3和下调Bcl-2、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表达以促进肺癌细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。

红景天苷对脑外伤大鼠海马神经元损伤及JNK3/caspase-3信号通路的影响

目的研究红景天苷(Sal)对脑外伤大鼠海马神经元损伤及c-Jun氨基末端激酶3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(JNK3/caspase-3)信号通路的影响。方法取6周龄雄性SD大鼠,参照改良Feeney法制备脑外伤大鼠模型,随机分为模型组、Sal低剂量组50 mg/(kg·d)灌胃、Sal中剂量组100 mg/(kg·d)灌胃、Sal高剂量组200 mg/(kg·d)灌胃,每组8只;另设假手术组、正常对照组,每组8只。正常对照组、模型组、假手术组均予以等量生理盐水灌胃,均持续12周。12周末处死,检测各组SD大鼠脑海马组织神经细胞形态变化及凋亡情况、氧化应激指标,包括超氧化物歧化物(SOD)、丙二醛(MAD),免疫印迹(WB)检测海马组织中p-JNK3/JNK3、cleaved-caspase-3蛋白表达水平。结果正常对照组与假手术组大鼠海马神经细胞形态正常,排列整齐,层次丰富,包膜完整。模型组大鼠海马区神经细胞萎缩,排列稀疏,层次减少。Sal低、中、高剂量组大鼠海马区神经细胞形态较模型组依次明显改善。与正常对照组、假手术组比较,模型组大鼠海马神经细胞凋亡、MDA含量、p-JNK3/JNK3、caspase-3蛋白水平显著增加(P<0.05),SOD活性降低(P<0.05);与模型组比较,Sal低、中、高剂量组神经细胞凋亡率、MDA含量、p-JNK3/JNK3、cleaved-caspase-3蛋白水平依次降低(P<0.05),SOD活性依次升高(P<0.05)。结论红景天苷可减轻脑外伤大鼠海马神经元氧化应激损伤,抑制其细胞凋亡,可能与抑制JNK3/caspase-3信号通路有关。

瑞芬太尼调节AKT/GSK-3β/Snail信号通路对肺癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的 探究瑞芬太尼(RF)调节蛋白激酶B(AKT)/糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)/Snail信号通路对肺癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响。方法 将非小细胞肺癌细胞A549分为低(RF-L)、中(RF-M)、高浓度RF(RF-H)组(10、20、40 nmol/L RF)、高浓度RF+AKT激活剂SC79(RF-H+SC79)组(40 nmol/L RF+4μg/mL SC79)和对照组(Control组)。CCK-8法检测细胞增殖能力。划痕实验检测细胞迁移能力。Transwell实验检测细胞侵袭能力。流式细胞术测量细胞凋亡。实时荧光定量PCR测定AKT、GSK-3β、Snail mRNA水平。Western Blot测定蛋白表达。结果 相较于Control组,RF-M、RF-H组48和72 h的OD450、细胞侵袭数目、划痕愈合率、AKT、GSK-3β、Snail mRNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白、EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin表达显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、Bax蛋白、E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。SC79减弱了RF对肺癌细胞增殖和EMT进程的抑制作用,减弱细胞凋亡。结论 RF可阻碍肺癌细胞EMT和增殖,诱导凋亡,这可能与AKT/GSK-3β/Snail信号通路的抑制相关。

黄连温胆汤调控IGF-1/PI3K/Akt信号通路对小鼠睡眠及认知障碍的影响

目的:探讨黄连温胆汤对小鼠睡眠及认知障碍的影响及相关机制。方法:将小鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、高剂量组、奥氮平组(阳性对照),各10例。除对照组外,其余各组小鼠通过腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)建立睡眠障碍小鼠模型。低剂量组、高剂量组每日灌胃黄连温胆汤(0.2 g/kg、0.8 g/kg),奥氮平组每日灌胃奥氮平(10 mg/kg),连续给药4周。采用戊巴比妥钠翻正实验检测小鼠睡眠质量,新物体识别实验检测各组小鼠鉴别指数(DI),Morris水迷宫实验检测各组小鼠空间学习记忆功能,苏木精-伊红(HE)染色检测各组小鼠海马组织病理变化,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组小鼠海马组织γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(GLU)水平,Western blot检测各组小鼠海马组织胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)蛋白表达水平。结果:与对照组比较,模型组小鼠睡眠潜伏期显著延长、睡眠时间显著缩短,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,低剂量组、高剂量组及奥氮平组小鼠睡眠潜伏期显著缩短,睡眠时间显著延长,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,模型组小鼠DI、目标象限探索时间、穿越平台次数、GABA、IGF-1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt水平显著降低,平台探索总时间、平台探索总距离、GLU水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,低剂量组、高剂量组及奥氮平组小鼠DI、目标象限探索时间、穿越平台次数、GABA、IGF-1、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt水平显著升高,平台探索总时间、平台探索总距离、GLU水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。黄连温胆汤或奥氮平可改善睡眠障碍小鼠的海马组织病理变化。结论:黄连温胆汤可显著改善小鼠睡眠及认知障碍,其机制可能与黄连温胆汤激活IGF-1/PI3K/Akt信号通路有关。

黑逍遥散调控Fas/FasL/Caspase-8/Caspase-3信号通路对AD大鼠神经元细胞凋亡的影响

目的:探究黑逍遥散调控肿瘤坏死因子受体超家族成员6(Fas)/Fas配体(FasL)/胱天蛋白酶-8(Caspase-8)/胱天蛋白酶-3(Caspase-3)信号通路干预神经元细胞凋亡防治阿尔茨海默病(AD)的作用及机制。方法:选用4月龄SPF级SD雄性大鼠90只,随机选取10只作为空白组,10只作为假手术组(双侧海马各注射生理盐水1μL),其余70只双侧海马各注射β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)1μL溶液复制AD模型。筛选出造模成功的大鼠50只,随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组(0.45 mg·kg^(-1))及黑逍遥散高、中、低剂量组(15.30、7.65、3.82 g·kg^(-1))。连续灌胃42 d,1次/d。原位末端标记法(TUNEL)染色观察大鼠皮层和海马神经元细胞凋亡情况,免疫组化法(IHC)检测大鼠海马组织B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测Fas、FasL、Fas相关死亡结构域蛋白(Fadd)mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Fas、FasL、Fadd、Caspase-3、切割型(cleaved)Caspase-3、Caspase-8、cleaved Caspase-8相关蛋白的表达。结果:与空白组和假手术组比较,模型组大鼠皮层和海马区细胞凋亡率显著升高(P<0.01),Bax水平显著增高(P<0.01),Bcl-2水平显著下调(P<0.01),海马组织Fas、FasL、Fadd mRNA表达显著提高(P<0.01),Fas、FasL、Fadd、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8蛋白表达显著增高(P<0.01);与模型组比较,盐酸多奈哌齐组及黑逍遥散高、中剂量组大鼠皮层和海马区细胞凋亡率明显下降(P<0.05,P<0.01),Bax水平显著降低(P<0.01),Bcl-2水平显著提高(P<0.01),海马组织Fas、FasL、Fadd mRNA表达明显下调(P<0.05,P<0.01),Fas、FasL、Fadd、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8蛋白表达显著下调(P<0.01);黑逍遥散低剂量组大鼠皮层和海马区细胞凋亡率明显下降(P<0.05,P<0.01),Bcl-2表达水平显著降低(P<0.01),海马组织FasL、Fadd mRNA表达明显下调(P<0.05),Fas、FasL、Fadd、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论:黑逍遥散可保护AD大鼠皮层和海马区神经元细胞凋亡,其作用机制可能与抑制Fas/FasL/Caspase-8/Caspase-3信号通路介导的细胞凋亡有关。

二甲双胍抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路保护骨关节炎模型大鼠关节软骨

背景:研究表明,二甲双胍具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老与血管保护作用,可抑制骨关节炎的进展,但其具体的作用机制仍不明确。目的:探讨二甲双胍对骨关节炎模型大鼠软骨保护的作用机制。方法:取40只雄性SD大鼠,采用随机数字表法分4组(n=10):空白组不进行任何手术,假手术组暴露关节腔,模型组、二甲双胍组采用改良Hulth法建立骨关节炎模型;造模后1 d,二甲双胍组大鼠灌胃给予二甲双胍200 mg/(kg·d),模型组、空白组、假手术组灌胃给予生理盐水,连续给药4周。给药结束后,苏木精-伊红、甲苯胺蓝和番红O-固绿染色观察大鼠膝关节软骨病理形态,免疫组化染色与Western blotting检测大鼠软骨组织中SOX9、Ⅱ型胶原、ADAMTS5、Beclin1、P62、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表达。结果与结论:①苏木精-伊红、甲苯胺蓝和番红O-固绿染色结果显示,空白组、假手术组大鼠膝关节软骨表面光滑,组织形态正常;模型组大鼠膝关节软骨表面不规则,软骨组织出现缺损,软骨细胞数量减少,软骨基质中蛋白多糖含量减少;相较于模型组,二甲双胍组大鼠膝关节软骨结构损伤有明显改善,软骨表面趋于平整,软骨细胞数量与软骨基质中蛋白多糖含量增加;②免疫组化染色与Western blotting检测结果显示,与空白组、假手术组比较,模型组大鼠软骨组织中SOX9、Ⅱ型胶原、Beclin1蛋白表达降低(P<0.05),ADAMTS5、P62及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,二甲双胍组大鼠软骨组织中SOX9、Ⅱ型胶原、Beclin1蛋白表达升高(P<0.05),ADAMTS5、P62及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达降低(P<0.05);③结果表明,二甲双胍可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化提高骨关节炎模型大鼠软骨细胞自噬活性、减少软骨基质降解,进而发挥关节软骨保护作用。

芩百清肺浓缩丸对感染后咳嗽大鼠NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的影响

目的:探讨芩百清肺浓缩丸(芩百)对感染后咳嗽(PIC)大鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1/白细胞介素1β(NLRP3/Caspase-1/IL-1β)信号通路的调节作用。方法:40只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组(阿斯美)及芩百清肺浓缩丸(芩百)组,每组10只。采用烟熏联合LPS滴鼻法及辣椒素雾化吸入法构建PIC模型。于造模后第18天开始灌胃给药,芩百组给予芩百清肺浓缩丸水溶液1.65 g/kg,阳性对照组给予阿斯美25.11 mg/kg,每日1次,连续给药10 d。末次干预后,ELISA检测BALF中IL-1β含量,、Western blot检测肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达。结果:与正常组相比,模型组BALF中IL-1β含量以及肺组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达均显著升高(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组和芩百组上述指标均显著降低(P<0.05);芩百组BALF中IL-1β水平和肺组织NLRP3蛋白表达均显著低于阳性对照组(P<0.05)。结论:芩百清肺浓缩丸能够显著减轻PIC大鼠的气道炎症和气道高反应性,其作用机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路有关。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨针灸预防应激性胃溃疡细胞焦亡的作用机制

目的:观察针刺与艾灸对应激性胃溃疡模型大鼠的防治作用及其对模型大鼠胃黏膜NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)细胞焦亡通路的干预作用,探索其作用机制。方法:将SD大鼠随机分为正常组、模型组、预灸组和预针刺组。预灸组和预针刺组大鼠分别予艾灸、针刺中脘、足三里,每穴刺激20 min,连续7 d;正常组、模型组大鼠仅予艾灸支架固定。除正常组外,其余各组大鼠采用无水乙醇与阿司匹林混悬液灌胃制备应激性胃溃疡模型。造模结束后次日,各组大鼠麻醉后取血分离血清,取胃黏膜组织。评估胃黏膜损伤指数(UI),苏木精-伊红(HE)染色法观察胃黏膜组织的病理形态变化,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-18水平,蛋白质免疫印迹(Western blot)法分析胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达。结果:模型组大鼠UI值明显高于正常组(P<0.01),胃黏膜组织明显损伤,存在出血灶,病理显示大量红细胞渗出;预灸组和预针刺组大鼠UI值均明显低于模型组(P<0.01),其中预灸组UI值明显低于预针刺组(P<0.05);预灸组和预针刺组胃黏膜组织表面只有少量出血灶,病理显示胃黏膜大体完整,有少量红细胞渗出,其中预灸组胃黏膜病变程度更轻。模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平均明显高于正常组(P<0.01);预灸组和预针刺组上述指标水平均明显低于模型组(P<0.05,P<0.01),其中预灸组上述指标水平均明显低于预针刺组(P<0.05,P<0.01)。模型组大鼠胃黏膜组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平均显著高于正常组(P<0.05);预灸组和预针刺组上述蛋白表达水平均明显低于模型组(P<0.05),其中预灸组Caspase-1蛋白表达水平明显低于预针刺组(P<0.05)。结论:针刺与艾灸均可以预防应激性胃溃疡胃黏膜损伤,其可能通过调控胃黏膜组织中NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路蛋白表达水平,缓解胃黏膜炎症反应,其中艾灸预处理对炎症因子的改善更具优势。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路研究生骨再造丸对BMSCs焦亡水平的干预效应

目的研究生骨再造丸通过NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路对BMSCs焦亡水平的影响。方法购买原代兔BMSCs,制备焦亡BMSCs模型,采用慢病毒技术及siRNA技术转染焦亡的BMSCs;制备生骨再造丸含药血清,对焦亡的BMSCs进行干预。将上述细胞分为空白组、模型组、慢病毒组、siRNA组、含药血清组。通过PCR检测各组BMSCs中GSDMD基因的表达水平;WB检测各组BMSCs中NLRP3、Caspase-1、GSDMD的表达水平;ELISA检测各组BMSCs中IL-1β、IL-18水平;通过CCK-8检测BMSCs活力。结果与空白组相比,模型组GSDMD基因表达增加(P<0.01),NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白水平显著升高(P<0.05)(P<0.01)(P<0.01),IL-18、IL-1β水平上升(P<0.01)(P<0.01)。与模型组相比,慢病毒组BMSCs中GSDMD基因表达升高(P<0.01),NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白水平增加(P<0.05)(P<0.05)(P<0.05),IL-18、IL-1β水平明显增加(P<0.01)(P<0.05);siRNA组BMSCs中GSDMD基因表达显著降低(P<0.01),NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白水平降低(P<0.01)(P<0.05)(P<0.05),IL-18、IL-1β水平明显降低(P<0.01)(P<0.01);含药血清组BMSCs中GSDMD基因表达降低(P<0.05),NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白水平降低(P<0.05)(P<0.05)(P<0.01),IL-1β、IL-18水平降低(P<0.05)(P<0.05)。结论NLRP3是调控BMSCs焦亡的关键靶点,生骨再造丸能通过降低NLRP3表达,抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路,调控BMSCs焦亡水平。