重构型Caspase-6对HeLa细胞凋亡的诱导作用

目的 将人Caspase 6基因大小亚基顺序颠倒 ,表达为重构型Caspase 6分子 ,探讨其对细胞凋亡的促进作用。方法 RT PCR获取人Caspase 6基因 ,测序判断正确后 ,通过重组PCR的方法构建大小亚基顺序颠倒的重构型Cas pase 6 (RevCasp6 )基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白 (GFP)基因的真核表达载体 pIRES2 EGFP中 ,转染人宫颈癌细胞系HeLa ,在荧光显微镜下观察细胞形态的变化 ,用电子显微镜进一步观察细胞的凋亡特征。结果 获得了人Caspase 6基因 ,并成功地构建了大小亚基顺序颠倒的RevCasp6基因。以构建的RevCasp6真核表达载体 ,转染HeLa细胞后 ,荧光显微镜观察到细胞生长不良、细胞核结构破坏和细胞死亡。电子显微镜观察显示 ,转染了RevCasp6基因的细胞呈凋亡的典型特征。

caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡

目的:探讨caspase-6对成骨肉瘤细胞株的凋亡诱导作用。方法:应用RT-PCR方法检测成骨肉瘤细胞株SOSP-9607中caspase-6基因的表达水平。以腺病毒adv5作载体,构建含caspase-6基因的转基因载体,用脂质体包裹法转染SOSP-9607细胞株,用RT-PCR方法检测转染后SOSP-9607细胞中caspase-6基因的表达。用MTF法检测转染caspase-6对SOSP-9607细胞株生长的影响。结果:成骨肉瘤细胞株SOSP-9607中未检出caspase-6表达。RT-PCR法证实转染。caspase-6后SOSP-9607中caspase-6表达显著增强,MTT检测显示对SOSP-9607细胞的生长有抑制作用,形态学观察及DNA电泳证实转染后的细胞株存在细胞凋亡特征。结论:caspase-6对成骨肉瘤细胞的生长有抑制作用,并可诱导成骨肉瘤细胞凋亡。

Caspase-3与Caspase-6蛋白在肾透明细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨Caspase-3、Caspase-6蛋白在肾透明细胞癌(RCCC)的表达及与预后的关系。方法采用免疫组化(SP法)对75例RCCC及其癌旁组织、15例正常肾组织标本中的Caspase-3、Caspase-6蛋白的表达进行研究,分析与RCCC临床病理特征及其术后生存率的关系。结果Caspase-3蛋白在RCCC中阳性表达率低于癌旁对照组,差异有显著性(P<0.01);在病理分级中的阳性表达率G3低于G1;在临床分期中的阳性表达率Ⅲ～Ⅳ期低于Ⅰ期;在淋巴结转移阳性组中阳性表达率低于阴性组,差异均有显著性(P<0.05)。Caspase-6蛋白在RCCC中阳性表达率低于癌旁对照组,差异有显著性(P<0.05);在不同病理分级和临床分期中阳性表达率差异均无显著性(P>0.05);在淋巴结转移阳性、阴性组中的阳性表达率差异无显著性(P>0.05)。在RCCC中,统计学显示Caspase-3与Caspase-6蛋白表达无相关性(C=0.0921,P>0.05)。在35例随访患者中,Caspase-3、Caspase-6蛋白表达阳性、阴性的术后3年死亡率差异均无显著性(P>0.05)。结论Caspase-3蛋白在RCCC中的阳性表达率低于癌旁和正常肾组织,与临床分期、病理分级呈负相关,其低表达与淋巴转移有关。Caspase-6蛋白在RCCC中的阳性表达率低于癌旁和正常肾组织,但与临床分期、病理分级及淋巴转移无关。在RCCC中,Caspase-3蛋白的表达与Caspase-6蛋白的表达无相关性。

白藜芦醇诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z凋亡过程中caspase-6的活化

目的:探讨白藜芦醇(Res)诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z凋亡过程中是否有caspase-6的活化。方法:用Western-blot分析caspase-6酶原的裂解,半定量RT-PCR检测caspase-6mRNA表达的改变,比色法测定caspase-6活性的变化。结果:用Res 0(对照)、25、50、100、200μmol/L处理细胞24小时,caspase-6酶原的表达随药物浓度的增加而减少,100 μmol/L时开始出现活性裂解片段P20(20 kD),200μmol/L时P20增加;caspase-6 mRNA的表达呈浓度依赖性的增加(P<0.01);caspase-6活性呈浓度和时间依赖性的升高(P<0.01)。结论:Res诱导CNE-2Z细胞凋亡过程中有caspase-6的活化。

小鼠皮肤切创愈合过程中caspase-6、-7表达的免疫组织化学研究

目的 观察皮肤切创损伤愈合过程中 ,caspase 6、 7在损伤周边区内的表达及其变化规律。方法 应用免疫组织化学技术观察伤后不同时间小鼠皮肤切创组织中caspase 6、 7的表达 ,以非切创小鼠皮肤组织作对照。 结果 伤后 6h的损伤皮肤组织中可见少量多核粒细胞表达caspase 6、 7,伤后 12～ 2 4h ,大部分浸润的多核粒细胞及部分单核细胞为caspase 6、 7阳性。随伤后时间延长 ,caspase 6、 7阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。伤后 0～ 3h ,caspase 6、 7阳性细胞比率较低 ,12h后逐渐增加 ,伤后 3d达高峰 ,其后逐渐下降。 结论 小鼠皮肤损伤愈合过程中 ,caspase 6、 7在损伤周边区内中性粒细胞 ,单核细胞及成纤维细胞中表达 ,其时序性变化规律可望用于皮肤损伤时间的推断。

人重构型caspase-6基因在Hela细胞中的诱导表达

目的 :将重构型caspase 6分子 (RCasp 6 )克隆入可诱导真核表达载体 pIND中 ,经蜕皮激素类似物诱导探讨其对细胞凋亡的促进作用。方法 :用PCR扩增RCasp 6基因 ,并克隆入真核表达载体pIND中。以重组体转染Hela细胞系 ,蜕皮激素类似物诱导。RCasp 6基因的表达产物采用免疫细胞化学染色检测。HE染色观察转染细胞的形态变化 ,并计数细胞绘制生存曲线。结果 :成功地构建了RCasp 6基因的可诱导真核表达载体。转染的细胞经蜕皮激素诱导后 ,细胞形态异常。转染了RCasp 6基因的细胞固缩同时很多细胞死亡。 结论 :RCasp 6基因具有促进细胞死亡的作用。

人重构型caspase-6基因在Hep-2细胞中的表达

目的 :观察人重构型caspase 6基因在Hep 2细胞中的表达及其对转染的Hep 2细胞的作用 .方法 :用RT PCR方法获取人caspase 6全长cDNA ,经重组PCR构建大小亚基次序颠倒的重构型caspase 6 (re caspase 6 ,简称rcasp6 ) .将所获重组基因克隆入真核表达载体pCMV ,转染Hep 2细胞 .用间接免疫荧光法及免疫细胞化学染色检测目的蛋白表达 ,HE染色和电镜观察转染细胞的形态和结构的变化 ,细胞计数检测转染目的基因后细胞生长状况的变化 .结果 :成功地获得了人重构型caspase 6基因 (rcasp6 ) ,并构建了真核表达载体 .转染Hep 2细胞后 ,检测到目的蛋白的表达 .倒置显微镜观察转染细胞有明显变化 ,培养情况下出现大量细胞固缩变小 ,伴随有细胞死亡 .HE染色和电镜观察显示 ,固缩的细胞呈现凋亡的典型特征 .结论 :人重构型caspase 6基因在Hep 2细胞中表达 ,可使转染细胞的形态发生变化 。

人重组caspase-6融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞靶向促凋亡作用

目的:探讨Her2靶向重组的caspase-6融合蛋白对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用。方法:将抗Her2单链抗体基因e23sFv与绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因(PEⅡ)和活性caspase-6基因连接,构建成Immunocasp-6(e23sFv-PEⅡ-casp-6)基因,将其克隆入真核表达载体pCMV中,转染SOSP-9607细胞,间接免疫荧光法检测目的基因表达和细胞形态学变化,通过AnnexinV染色、流式细胞术、MTT法检测来观察其促肿瘤细胞凋亡的作用。结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测出caspase-6的表达,SOSP-9607细胞出现明显的核浓缩、碎裂;电镜观察到细胞质浓缩,胞内空泡,核染色质浓集等典型的凋亡特征;MTT法检测发现细胞的增殖明显被抑制;AnnexinV染色流式细胞术检测可见明显的凋亡细胞,凋亡率为31.4%,较对照组细胞(凋亡率为6.0%)有非常显著的增加(P<0.01)。结论:重组Immunocasp-6基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并诱导细胞发生凋亡。

重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的构建、表达及其活性鉴定

目的:构建重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达载体,转染SGC7901胃癌细胞后观察其促凋亡作用.方法:采用重组PCR法,将抗HER2的单链抗体(e23sFv)通过白喉毒素的Furin识别位点的编码序列(FDT)与人重构型caspase-6(RC6)基因重组,构建融合蛋白表达基因e23sFv-FDT-RC6.将所获得的重组基因克隆入真核表达载体pCMV,以脂质体法瞬时转染HER2阳性的SGC7901细胞和HER2阴性的HeLa细胞.MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况.间接免疫荧光染色观察目的基因的表达对SGC7901细胞的促凋亡作用.结果:把e23sFv-RC6,e23sFv-FDT-RC6基因克隆入真核表达载体pCMV,酶切鉴定和基因测序证明目的基因序列正确.转染SGC7901和HeLa细胞后,Western Blot检测到目的蛋白的表达.MTT实验观察到转染pCMV-e23sFv-FDT-RC6的SGC7901细胞的增殖被明显抑制,间接免疫荧光染色可以观察到表达e23sFv-FDT-RC6融合蛋白的SGC7901细胞形态发生改变,部分细胞呈现典型凋亡特征.结论:重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达可促进HER2阳性SGC7901胃癌细胞的凋亡.

大鼠皮肤挫伤修复过程中caspase-6的表达及其时间规律性

目的探讨皮肤挫伤修复过程中,caspase-6在挫伤区及挫伤周边区不同时间表达的变化规律。方法应用免疫组化染色、Westernblot技术显示caspase-6在皮肤挫伤区及挫伤周边区炎性细胞中的阳性表达和激活情况。结果伤后3h,挫伤区内浸润的少量多核粒细胞的胞质中caspase-6呈弱阳性表达,阳性率为(25.78±1.38)%;伤后12h,阳性表达增强明显,阳性率为(47.70±5.14)%;伤后3d,几乎所有多核粒细胞、单核细胞和成纤维细胞中caspase-6呈强阳性表达,阳性率为(54.58±5.64)%,表达达高峰,以后逐渐下降。Westernblot实验证明,caspase-6酶原表达呈现时间规律性变化。结论大鼠皮肤挫伤修复过程中,caspase-6在挫伤后的炎症反应中发挥重要作用;同时,caspase-6在挫伤区内多核粒细胞、单核细胞及成纤维细胞中的表达呈规律性变化,可对挫伤时间的推断提供参考。

高三尖杉酯碱诱导鼻咽癌细胞CNE-2Z凋亡过程中Caspase-6、-8的活性变化

目的 了解高三尖杉酯碱 (HHT)诱导CNE 2Z细胞凋亡过程中Caspase 6、 8的活性变化。方法 用不同浓度 (0 .12 5、0 .2 5、0 .5、1μg/ml)的HHT分别处理CNE 2Z细胞 1、2、4、8、12、2 4h ,用比色法检测其Caspase 6、 8的活性 (A40 5nm表示 )。结果 1μg/mlHHT处理CNE 2Z细胞 1h即可见Caspase 8活性明显高于两个对照组 (未处理组和抑制剂 +药物处理组 ,P <0 .0 1) ,2h达高峰。而Caspase 6的活性在 4h开始升高 ,12h达高峰 ,2 4h仍明显高于对照组 (P <0 .0 1)。不同浓度的HHT处理CNE 2Z细胞 ,Caspase 6在 12h、Caspase 8在 2h时均可见它们的活性明显高于两个对照组 (P <0 .0 1) ,且随HHT浓度的增加而活性增强。结论 Caspase 6、 8参与了HHT诱导的CNE 2Z细胞凋亡 ,且其活性升高有时间和浓度依赖性。

鞘内注射Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK对小鼠福尔马林炎性痛的影响

目的研究鞘内注射Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK对小鼠福尔马林炎性痛的影响。方法采用小鼠右后足底皮内注射5%福尔马林溶液建立疼痛模型,32只小鼠根据随机数字表法分成四组:空白组、溶媒组、低剂量组和高剂量组,每组8只。空白组仅建立疼痛模型,溶媒组、低剂量组和高剂量组分别鞘内注射20%二甲基亚砜(DMSO)、5μg Z-VEID-FMK和10μg Z-VEID-FMK,给药体积为5μL,随后建立疼痛模型。观察福尔马林炎性痛小鼠舔/咬脚时间,比较模型建立前及建立后60 min小鼠足底的厚度。结果各组小鼠足底皮内注射福尔马林后均出现明显的双时相疼痛反应,在一相痛中,低剂量组[(88.88±6.98)s]、高剂量组[(90.09±8.49)s]与溶媒组[(90.50±11.18)s]小鼠舔/咬脚时间比较,差异无统计学意义(P>0.05);在二相痛中,与溶媒组[(220.25±80.80)s]比较,低剂量组[(81.25±14.10)s]、高剂量组[(50.63±10.77)s]小鼠舔/咬脚时间均显著缩短,差异有高度统计学意义(P<0.01)。与溶媒组[(1.78±0.02)mm]比较,低剂量组[(1.31±0.07)mm]及高剂量组[(1.11±0.08)mm]小鼠足底肿胀显著降低,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论 Caspase-6抑制剂Z-VEID-FMK可以缓解小鼠福尔马林炎性痛,可能与其抑制炎性因子作用有关。

Caspase-3与Caspase-6蛋白在肾透明细胞癌中的表达及意义

目的检测Caspase-3、Caspase-6蛋白在肾透明细胞癌(RCCC)、癌旁、正常肾组织中的表达,探讨两者在不同临床分期、病理分级的表达及与预后的关系,并分析两者的相关性。方法采用免疫组化的方法检测75例RCCC及其癌旁组织、15例正常肾组织标本中的Caspase-3和Caspase-6蛋白表达水平。结果 Caspase-3和Caspase-6蛋白在RCCC中的阳性表达率(74.67%,76.00%)低于癌旁组织(92.00%,90.67%)和正常肾组织(93.33%,86.67%),差异有统计学意义(P<0.05)。Caspase-3病理G3期阳性表达率(53.58%)低于G1期(87.50%),P<0.05;临床Ⅲ、Ⅳ期阳性表达率(63.64%)低于Ⅰ期(87.97%),P<0.05;淋巴结转移阳性组中阳性表达率(55.56%)低于阴性组(80.70%)。Caspase-6在不同病理分级和临床分期以及是否有淋巴结转移中阳性表率无显著性差异。两者在RCCC中的阳性表达率无相关性(C=0.0921,P>0.05)。结论 Caspase-3和Cas-pase-6表达减少导致细胞凋亡减少、与肾细胞癌发病有密切关系,但不是肾细胞癌有价值的标记物。且两者的表达降低并不存在相关性。

Caspase-6诱导肾癌细胞株GRC-1细胞凋亡的研究

目的 探讨 Caspase- 6在肾癌细胞株 GRC- 1中的表达及其对肾癌细胞的凋亡诱导作用。方法 应用 RT- PCR方法检测了肾癌细胞株 GRC- 1中 Caspase- 6基因的表达水平 ;以腺病毒 adv5作载体 ,构建了含 Caspase- 6基因的转基因载体 ,用脂质体包裹法转染 GRC- 1细胞株 ,用 RT-PCR方法检测转染后 GRC- 1细胞中 Caspase- 6基因的表达。 MTT法检测转染 Caspase- 6对GRC- 1细胞株生长的影响。结果 肾癌细胞株 GRC- 1中未检出 Caspase- 6表达。 RT- PCR法证实转染 Caspase- 6后 GRC- 1中 Caspase- 6表达明显 ,MTT检测显示对 GRC- 1细胞的生长有抑制作用 ,通过形态学观察及 DNA电泳证实这种作用主要是通过促进细胞凋亡而实现的。结论 Cas-pase- 6对肾癌细胞的生长有抑制作用 ,并可诱导肾癌细胞凋亡。

蛋白酶Caspase-6在腰椎间盘髓核组织中表达的研究

目的探讨凋亡相关蛋白酶Caspase-6在腰椎间盘退变中的作用。方法将45例腰椎间盘突出症病人作为手术组,并分为:青年组;中年组;老年组。5例青少年型特发性脊柱侧弯病人作为对照组。对照组标本均为术中所取出L2/3新鲜椎间盘髓核组织;手术组标本均为术中所取出L4/5新鲜椎间盘髓核组织;采用TUNEL法和免疫组织化学S-P法,分别检测腰椎间盘髓核中的凋亡阳性细胞率及Caspase-6的表达情况。结果青年、中年、老年手术组髓核内TUNEL阳性细胞率分别为(45.71±2.05)%、(53.65±2.93)%、(68.39±4.33)%。对照组髓核内TUNEL阳性细胞率为(17.80±0.62)%。四个组两两之间差异均有统计学意义(P<0.05)。髓核内TUNEL阳性细胞率与年龄呈正相关(P<0.01)。青年、中年、老年手术组髓核内Caspase-6染色阳性细胞率分别为(38.58±1.80)%、(53.19±2.67)%、(62.72±4.65)%。对照组髓核内Caspase-6染色阳性细胞率为(19.32±1.49)%。四个组两两之间差异均有统计学意义(P<0.05)。髓核内Caspase-6染色阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率和年龄之间均呈正相关(P<0.01)。结论细胞凋亡参与了腰椎间盘退变过程,年龄是细胞凋亡的重要影响因素;腰椎间盘组织细胞凋亡过程有Caspase-6蛋白酶参与调节,Caspase-6的表达上调可能在腰椎间盘退行性变发生和发展中发挥重要作用。

人重组型caspase-6融合蛋白对骨肉瘤的促凋亡作用

目的 探讨人类表皮生长因子受体2（Her-2）靶向重组型caspase-6融合蛋白对骨肉瘤的促凋亡作用.方法 将抗Her-2单链抗体基因e23sFv、绿脓杆菌外毒素PE的转膜结构域基因（PEⅡ）和重组型caspage-6基因连接,构建成Immunocasp-6（e23sFv-PE Ⅱ-casp-6）融合蛋白,将其亚克隆入真核表达载体pCMV中,构建pCMV-e23sfv-PE Ⅱ-caspase-6载体（简称pCMV-6）.将荷瘤裸鼠随机分为治疗组和对照组,采用阳离子脂质体包裹法,将pCMV-6和pCMV分别肌肉注射入荷瘤裸鼠身上,观察肿瘤体积和裸鼠体重的变化,并称取肿瘤重量.采用HE染色法观察肿瘤组织形态学变化,采用末端脱氧核苷酸转移酶标记技术（TUNEL）检测肿瘤组织的凋亡形态,采用免疫组织化学染色检测目的基因的表达.结果 对照组的肿瘤体积、肿瘤重量和裸鼠体重分别为（975.09±49.76）mm3、（1.08±0.16）g和（4.07±0.49）g,治疗组分别为（376.01±265.18）mm2、（0.64±0.18）g和（6.20±1.14）g.HE染色和TUNEL法检测显示,治疗组裸鼠肿瘤组织呈现出典型的凋亡特性,而对照组裸鼠肿瘤组织结构正常.免疫组织化学染色显示,caspase-6在治疗组裸鼠肿瘤组织中呈阳性,而在对照组肿瘤组织和肌肉组织中呈阴性.结论 人重组型caspase-6融合蛋白能靶向性识别、结合Her-2阳性的骨肉瘤细胞,并诱导其发生凋亡,为骨肉瘤的临床治疗提供了一定的实验基础.

免疫凋亡素e23sFv-Fdt-RC6对HER2阳性胶质瘤细胞U251的杀伤作用

目的:探讨靶向活性caspase-6融合蛋白对HER2阳性胶质瘤细胞系U251的促凋亡作用。方法:利用白喉毒素furin酶识别序列(Fdt)连接抗HER2单链抗体基因e23sFv和重构型caspase-6(RC6)基因,连接入pCMV载体,构建重组基因的真核表达载体pCMV-e23sFv-Fdt-RC6。脂质体转染HER2阳性胶质瘤U251细胞系,Western blot检测目的蛋白的表达。流式细胞术(FCM)检测转染后U251细胞的凋亡率,MTT法检测目的基因转染后对U251细胞增殖的影响。结果:双酶切及基因测序证实,pCMV-e23sFv-Fdt-RC6载体被成功构建。Western blot检测到转染表达载体48h后的U251细胞中有活性caspase-6的表达。FCM检测到实验组细胞凋亡率比对照组显著增高。MTT实验观察到转染载体pCMV-e23sFv-Fdt-RC6的U251细胞的增殖被明显抑制。结论:e23sFv-Fdt-RC6融合蛋白对HER2阳性胶质瘤细胞系U251有明显的促凋亡作用。

橙皮苷抑制JNK信号通路辅助治疗2型糖尿病大鼠

目的探讨橙皮苷治疗2型糖尿病大鼠后,其肝脏JNK信号通路3个关键分子JNK、P-JNK、Caspase-6表达的特点。方法 40只雄性SD大鼠,随机分为空白组(12只),模型组(14只),橙皮苷治疗组(14只),模型组和橙皮苷治疗组高脂饮食6个月形成2型糖尿病模型,治疗8周后收集肝脏行免疫组化检测JNK、P-JNK、Caspase-6分布及表达;Western blot及RT-PCR测定3个蛋白和mRNA表达。结果免疫组化结果示橙皮苷治疗组肝细胞相应蛋白表达JNK、P-JNK、Caspase-6较模型组减少(P<0.05),但和空白组差距仍然较大(P<0.05);JNK、P-JNK、Caspase-6蛋白以及mRNA表达,橙皮苷组低于模型组(P<0.05),但和对照组仍有一定的差异(P<0.05),胰岛素抵抗指数与上述3个蛋白改变趋势一致。结论橙皮苷可降低2型糖尿病胰岛素抵抗指数,其机制可能是通过抑制JNK信号通路中JNK、p-JNK以及Caspase-6的表达实现的。