益肾通络方对少弱精子症大鼠睾丸组织PI3K-AKT-mTOR通路、CatSper-1、HSPA2蛋白及mRNA表达的影响

目的:基于PI3K-AKT-mTOR通路研究益肾通络方对少弱精子症模型大鼠睾丸组织的影响及作用机制。方法:将SPF级雄性SD大鼠48只,随机分为正常对照组、模型组、左卡尼汀组、益肾通络方(YTP)组(高、低剂量组)、Omipalisib抑制剂(OI)组、Omipalisib抑制剂+益肾通络方高剂量组(OI+YTP高剂量组)、Omripalisib抑制剂+益肾通络方低剂量组(OI+YTP低剂量组),每组各6只。除正常对照组外其余大鼠均在雷公藤多苷灌胃建立少弱精子症模型大鼠基础上给予相对应药物,镜下观察各组大鼠精子参数,HE染色观察各组睾丸组织病理变化,Western印迹和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白及mRNA表达情况。结果:与模型组相比,左卡尼汀组、YTP高剂量组、YTP低剂量组在精子浓度和精子活力(PR、PR+NP)方面均显著提高(P<0.001);HE染色结果显示模型组生精细胞排列不整齐,生精小管管腔缩小,间隙变宽等,左卡尼汀组、YTP高剂量组、YTP低剂量组也观察到了与模型组相似的病理改变,但同时也观察到了较为完好的精子细胞且在数量相对模型组较多,OI组、OI+YTP高剂量组、OI+YTP低剂量组的病理改变与模型组相近。Western印迹结果显示:与模型组相比,左卡尼汀组可上调p-AKT、CatSper-1、HSPA2蛋白表达量(P<0.05),YTP低剂量组可上调p-AKT、mTOR、CatSper-1、HSPA2蛋白表达量(P<0.05),YTP高剂量组除可上调上述蛋白表达外,还可上调PI3K蛋白表达量(P<0.05);OI组PI3K、mTOR、CatSper-1的蛋白表达量与模型组对比无差异(P>0.05);OI+YTP高剂量组及OI+YTP低剂量组PI3K、p-AKT、mTOR、CatSper-1、HSPA2的蛋白表达与模型组、OI组对比无差异(P>0.05)。qRT-PCR结果显示:与模型组相比,左卡尼汀组、YTP高、低剂量组均可上调PI3K mRNA、mTOR mRNA、CatSper-1 mRNA、HSPA2 mRNA表达(P<0.05);YTP高剂量组可显著上调CatSper-1 mRNA表达(P<0.001),且与YTP低剂量组对比时,YTP高剂量组可以更有效上调PI3K的mRNA表达(P<0.05)。OI组PI3K、mTOR、CatSper-1、HSPA2的mRNA表达与模型组对比无差异(P>0.05);OI+YTP高剂量组及OI+YTP低剂量组PI3K、mTOR、CatSper-1、HSPA2的mRNA表达与模型组、OI组对比无差异(P>0.05)。结论:益肾通络方可改善雷公藤多苷诱导的少弱精子症SD模型大鼠精子质量及睾丸组织病理形态变化,其机制可能与该方上调了睾丸组织PI3K-AKT-mTOR通路的相关蛋白及mRNA表达有关。

构建重组人CatSper1特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-599)原核表达载体并表达重组抗原。方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体。测序鉴定后转化工程菌株E.coliBL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白。用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况。结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原。结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsper1特异抗原。