“益精方”对小鼠精子尾部特异性钙通道CatSper1的影响

目的:观察"益精方"对环磷酰胺所致少弱精子症模型小鼠精子尾部特异性钙通道CatSper1的影响。方法:将40只雄性昆明小鼠随机分为对照组(CG)、模型组(MG)、小剂量中药治疗组(SG)和大剂量中药治疗组(LG),按60mg/kg体重给CG小鼠腹腔注射生理盐水(NS),给MG、SG、LG小鼠腹腔注射环磷酰胺,每天1次,连续5d,第6d开始按体重分别给SG和LG小鼠灌服"益精方",剂量分别为人类常规用量(以60kg为标准)的1倍和5倍,MG小鼠给予等体积的NS灌胃,每天1次,连续34d,CG常规饲养,然后对小鼠进行精液常规分析,并用RT-PCR法检测小鼠精子CatSper1的表达。结果:CG、MG、SG和LG组小鼠附睾精子密度分别为(5.20±1.34)、(1.73±0.03)、(2.08±0.01)、(3.31±0.56)×106/ml,a+b级精子百分率分别为(14.49±0.30)%、(6.64±1.88)%、(11.99±1.01)%、(19.40±3.13)%,a+b+c级精子百分率分别为(68.39±15.13)%、(39.96±4.89)%、(62.28±4.43)%、(73.61±5.05)%,MG组精子密度、a+b级精子百分率、a+b+c级精子百分率显著低于CG组(P<0.05),经治疗后LG组精子密度、a+b级精子百分率、a+b+c级精子百分率明显增加,与MG组比较有显著性差异(P<0.05),而与CG组在a+b级精子百分率和a+b+c级精子百分率上没有明显区别。CatSper1的表达量在CG、MG、SG和LG组分别为0.76±0.05、0.73±0.03、0.75±0.12、0.85±0.04,LG组显著高于MG组(P<0.05),而与CG组比较没有明显区别。结论:腹腔注射环磷酰胺可使小鼠精子密度、a+b级精子百分率、a+b+c级精子百分率降低,CatSper1表达量下降,大剂量"益精方"可以通过提高CatSper1的表达量,增加小鼠精子密度、a+b级和a+b+c级精子百分率,从而达到治疗少弱精子症的目的。

CATSPER1蛋白与特发性弱精子症关系的研究

目的:探讨CATSPER1蛋白在特发性弱精子症发病中的作用。方法:采用非连续密度梯度离心分离精子,免疫细胞化学技术检测CATSPER1蛋白在特发性弱精子症患者精子中的定位及表达变化;同时用蛋白印迹技术检测CATSPER1蛋白在正常对照组及轻度弱精子症组、中度弱精子症组和重度弱精子症组中表达的差异,进行统计学分析。结果:CATSPER1蛋白定位于精子鞭毛主段;与正常对照组相比,CATSPER1在弱精子症患者中的表达下降,差异具有显著性(t=2.188,P=0.042);CATSPER1蛋白在正常对照组、轻度弱精子症组、中度弱精子症组和重度弱精子症组中的相对含量分别为(0.806±0.266)、(0.669±0.207)、(0.505±0.214)、(0.295±0.162),与对照组相比,CATSPER1蛋白相对表达量在各弱精子症组均存在不同程度的下降,差异存在显著性(P<0.05)。前向运动精子(a+b级)百分率与CATSPER1蛋白的含量成正相关(r=0.633,P=0.000)。结论:CATSPER1蛋白表达下降或异常可能是导致特发性弱精子症发生的一个环节。

CatSper1在小鼠睾丸发育过程中的动态表达及与人精子活力的关系

目的研究CatSper1 mRNA在小鼠睾丸发育过程中的动态变化,并探讨CatSper1蛋白表达与精子运动的关系。方法采用荧光实时逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)相对定量法检测CatSper1 mRNA在出生后11、15、18、21、25、28、35、42、56和120 d龄C57BL/6小鼠(每天龄3只)睾丸中的表达;分别从4例正常精液标本中用四层密度梯度Percoll(浓度分别为95%、76%、57%和47.5%)离心分离出高活力和低活力精子,用于Western Blot定量检测CatSper1蛋白的表达。结果CatSper1 mRNA在18 d龄小鼠睾丸开始表达,在25和28 d龄表达上调明显,分别为21 d龄表达水平的2.95和7.59倍。自42 d后上调缓慢,至成年小鼠时达到最高水平。CatSper1蛋白在每例标本高活力精子中的表达量均显著高于低活力精子(P<0.05)。结论CatSper1与精子活力特性有关,为进一步研究CatSper家族各成员间的关系和确切功能提供参考依据。

用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的:建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。

精索静脉曲张病人精子特异性钙通道CatSper1 mRNA表达

目的探讨精索静脉曲张病人精子中精子特异性钙通道CatSper1mRNA的表达,及其与精索静脉曲张的关系。方法采用计算机辅助精液分析(CASA)系统,对77例精索静脉曲张病人的精液进行分析,根据WHO标准分为精索静脉曲张精液正常组(B组)28例,精索静脉曲张精液异常组(C组)49例;健康体检精液正常20例为A组,采用90/40Percoll非连续梯度离心法分离各组精液,半定量逆转录-聚合酶链反应技术检测3组精子CatSper1mRNA的表达。结果 C组CatSper1mRNA的表达与A、B组比较,差异有显著性(F=7.20,q=5.18、4.75,P<0.01);B组CatSper1mRNA的表达与A组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论 CatSper1mRNA表达异常可能是导致精索静脉曲张病人精液质量下降从而不育的原因之一,此为精索静脉曲张病人不育的病因及治疗提供了新的研究方向。

构建重组人CatSper1特异抗原原核表达载体

目的:构建重组人Catsper1特异抗原(含胞外区、钙选择孔区和破伤风类毒素通用T细胞表位TT580-599)原核表达载体并表达重组抗原。方法:设计引物,以RT-PCR法扩增人CatSper1的整个跨膜区DNA片段,利用重叠PCR方法合成重组人CatSper1特异抗原DNA片段,并插入到pET-21b和pET-21b-Trx(硫氧还蛋白)的原核表达载体。测序鉴定后转化工程菌株E.coliBL21(DE3)进行诱导表达,并纯化表达的重组蛋白。用Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析重组蛋白的表达情况。结果:成功构建pET-21b-Catsper1特异抗原和pET-21b-Trx-Catsper1特异抗原原核表达载体,并在BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。Tricine-SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明,已获得重组人CatSper1特异抗原包涵体和纯化的可溶重组Trx-Catsper1特异抗原。结论:成功在原核表达系统表达重组人Catsper1特异抗原。

定远猪CATSPER1基因多态性及与产仔数的相关分析

利用现代分子标记技术探索了影响猪产仔数的候选基因CATSPER1多态性,并分析了多态性与产仔数间的相关性,为建立产仔数分子标记辅助选择方法提供依据。试验采用PCR-RFLP(HhaI限制性内切酶)技术,分析了264头定远猪母猪的CATSPER1基因exon 1的c.A779G多态性,并采用最小二乘法分析了CATSPER1基因多态性对产仔数影响的遗传效应。结果显示,CATSPER1基因c.A779G位点在定远猪中存在多态性,AA、AG和GG型频率分别为0.030 3、0.272 7和0.697 0,野生型等位基因A的基因频率为0.166 7,经检验该位点在定远猪群中处于哈德-温伯格平衡状态(P>0.05);AA型个体的总产仔数和产活仔数最高,GG型个体最低,AA型总产仔数均极显著高于AG和GG型(P<0.01),AA型个体的产活仔数均显著高于AG和GG型(P<0.05),而AG和GG型个体间的总产仔数和产活仔数均差异不显著(P>0.05);遗传效应分析表明,等位基因A为定远猪优良等位基因,A等位基因替代G等位基因的效应均为正值,因此选择AA型个体留种有利于提高群体的产仔数。

抗CATSPER1抗体对精子运动的影响

目的探讨CATSPER1蛋白在精子运动中的功能。方法将正常精液标本与终浓度分别为0.8μg/mL、4μg/mL、20μg/mL的CATSPER1抗体混合孵育,然后于37℃1h、2h、6h用计算机辅助分析系统(CASA)进行精液参数分析。结果在不同时间,前向运动精子(a+b级)、快速前向运动精子(a级)的百分比均较对照组明显减少并且成剂量依赖性,慢速前向运动精子(b级)受抗体抑制的作用不明显。结论 CATSPER1在精子运动过程中发挥重要功能,CATSPER1抗体主要抑制精子快速前向运动能力。

五子衍宗丸对少弱精子症模型大鼠睾丸组织Catsper1蛋白及其mRNA表达影响

目的通过检测大鼠睾丸组织Catsperl蛋白及其mRNA表达水平，探讨五子衍宗丸治疗少弱精子症的作用机制。方法将体质量200-220g的雄性SD大鼠随机分成正常组，模型组，生精胶囊组，五子衍宗丸低剂量、中剂量、高剂量组。采用连续灌服雷公藤多苷8周的方法复制少弱精子症模型，模型复制成功后连续给药4周。采用Westernblot法测定Catsperl蛋白含量，采用荧光定量PCR法测定CatsperlmR—NA表达水平，采用酶联免疫吸附试验检测睾丸组织中cAMP含量。结果生精胶囊和高剂量五子衍宗丸能明显提高模型大鼠睾丸组织中降低的cAMP含量以及升高睾丸组织中降低的Catsperl蛋白及其tuRNA表达水平（P〈0．05）。结论促进Catsperl蛋白表达并参与cAMP-Ca2＋正反馈可能是五子衍宗丸提高精子质量的机制之一。

人精子CatSper1 mRNA表达与精子活力的相关性研究

目的研究不同精子活力的人精子中精子特异性阳离子通道蛋白1(CatSper1)mRNA的表达差异,以及其与精子活力相关指标的相关性。方法分别收集少、弱精症患者精液标本和健康人对照精液标本各25份,用Trizol试剂提取精子中的总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CatSper1 mRNA表达改变。结果少、弱精症组CatSper1 mRNA表达水平与健康人对照组相比,差异具有统计学意义[(0.54±0.01)vs(1.13±0.05),P<0.01]。CatSper1 mRNA表达与精子活率以及a+b级精子百分率之间呈显著正相关。结论人精子CatSper1 mRNA表达与人精子活力呈正相关。

真核表达CatSper1用于筛选有效siRNA的体外实验研究

目的构建pEGFP-N1-CatSper1重组质粒,在真核细胞中表达CatSper1,利用化学合成siRNA抑制小鼠CatSper1基因的表达,并筛选抑制效果最佳的siRNA序列。方法利用重组PCR克隆小鼠CatSper1全长cDNA,构建到真核表达载体中。生物信息分析软件校正结果,获得三条针对雄性小鼠CatSper1的siRNA序列,合成后分别与重组质粒pEGFP-N1-CatSper1共转染到小鼠成神经瘤N2a细胞株中,通过观察EGFP荧光强度、实时定量聚合酶链反应和WesternBlot等方法,分析干扰效果,筛选能显著降低N2a细胞中外源性CatSper1表达量的siRNA序列。结果成功克隆小鼠CatSper1基因的全长cDNA片段(2,061 bp),并构建到pEGFP-N1表达载体中。三个siRNA干扰组的CatSper1 mRNA和蛋白表达与空白对照组相比均下降,其中以靠近3′端的siRNA干扰作用更为明显,阴性对照siRNA组未引起CatSper1 mRNA和CatSper1蛋白表达明显变化。结论在小鼠神经瘤N2a细胞株中成功表达外源性CatSper1蛋白,并筛选出有效的siRNA,为深入研究CatSper1功能及用于避孕提供参考。

基于转录组测序研究CatSper1在版纳微型猪近交系睾丸组织中的转录调控特征

目的CatSper1是精子特定的电压门控Ca^(2+)通道蛋白,在精子生成和受精过程中具有重要作用。本研究旨在分析CatSper1基因在版纳微型猪近交系(BMI)的表达调控模式、序列特征与潜在的生物学功能。方法取成年BMI公猪睾丸进行转录组测序;采用RT-PCR技术克隆CatSper1的完整编码序列;分析CatSper1的序列、结构特征及相互作用蛋白;利用转录组测序数据构建CatSper1的lncRNA和miRNA调控网络,并进行GO功能注释。结果RNA-seq获得CatSper1基因的平均表达量和平均TPM值分别为2817.5和33.6。CatSper1 CDS区全长为2166 bp(GenBank登录号:OK042306),编码721个氨基酸,含有233个氨基酸残基组成的Ion_trans保守结构域以及与精子生成相关的保守跨膜螺旋结构。CatSper1蛋白与10个雄性育性相关蛋白质存在相互作用,尤其与该基因家族成员CatSper2-4蛋白互作最为紧密。CatSper1基因受10个miRNAs靶向调控,分别有16个和14个lncRNAs与CatSper1竞争性结合ssc-miR-1343和ssc-miR-744。GO注释发现CatSper1基因在分子功能(MF)、生物学过程(BP)、细胞成分(CC)等方面均具有重要功能。结论本研究报道了CatSper1在BMI睾丸中的表达,基因的分子结构特征和表达调控网络,为深入研究CatSper1基因在BMI精子发生、精子获能和顶体反应等重要生物学过程中的功能奠定了基础。

精子特异性钙通道CatSper1对精子线粒体呼吸与能量代谢的影响

目的:应用Cat Sper1单克隆抗体抑制Cat Sper1的功能,检测精子线粒体呼吸功能及能量合成能力,观察Cat Sper1对精子线粒体呼吸与能量代谢的影响。方法:健康志愿者20例,检测精液均符合WHO健康标准。手淫法获取精液,经过上游法处理后每份精液分为A、B两组,分别与Earles液以及50μg/m L抗Cat Sper1多克隆抗体共孵育。在1 h,2 h,4 h后分别检测两组精子精液参数、细胞线粒体呼吸控制率RCR及精子细胞ATP含量。结果:与A组比较,B组精子各时间点a+b(%)尤其是a(%)均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01);1 h后B组精子a(%)即明显下降,2 h,4 h后精子下降缓慢,与1 h相比无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。与A组比较,B组精子各时间点态3值、呼吸控制率RCR以及精子细胞ATP含量均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01);B组精子中,2 h、4 h节点精子态3值、呼吸控制率RCR以及精子细胞ATP含量与1 h无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。结论:阻断精子特异性钙通道Cat Sper1,可降低精子细胞线粒体呼吸功能,减少精子生成ATP的能力,从而使精子活力降低。为精索静脉曲张引起精子Cat Sper1表达下降,从而导致不育的机制寻找可能的理论依据。

Catsper1单核苷酸多态性及其与种公牛精液品质的相关性分析

采用PCR-SSCP技术对45头种公牛Catsper1基因的单核苷酸多态性进行了检测。结果发现,在Catsper1基因的5′UTR、exon-1、intron-1和3′UTR上存在多态性,5′UTR、exon-1和3′UTR分别存在2种基因型,即AA/AB、A′A′/A′B′和EE/EF型,intron-1存在3种基因型,即CC型、DD型和CD型。对多肽片段克隆测序,结果显示,在Catsper1基因5′UTR上存在2个碱基突变,即C65T和T28C;在exon-1上存在G144A的突变,并且该位点的突变导致了氨基酸序列由甘氨酸变为丝氨酸;在intron-1上存在C167T的突变;在3′UTR存在C202T的突变。利用SPSS 12.0软件分析了西门塔尔牛和夏洛莱牛Catsper1基因的遗传多态性与精液品质的相关关系,结果表明:5′UTR与exon-1位点的突变对鲜精活力、冻精活力、鲜精顶体完整率和冻精顶体完整率有显著影响(P<0.05);intron-1位点对射精量和冻精畸形率有显著影响(P<0.05);3′UTR位点对精子浓度和鲜精活精子比率有显著影响(P<0.05)。

"促育生精方"对环磷酰胺致大鼠不育模型CatSper1基因和CatSper2基因的影响（英文）

目的:研究"促育生精方"对精子特异性钙通道蛋白Cat Sper1、Cat Sper2表达的影响。方法:采用Real-time PCR法检测Cat Sper1 m RNA、Cat Sper2 m RNA在各组大鼠(模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、空白对照组)精子中的表达;用Western blot检测各组Cat Sper1蛋白,Cat Sper2蛋白的表达。结果:成功建立大鼠不育模型。Cat Sper1 m RNA、Cat Sper2 m RNA表达量为:中、高剂量组显著高于模型组(P<0.05)。Cat Sper1、Cat Sper2蛋白表达量:中、高剂量组显著高于模型组(P<0.05)。结论:促育生精方能有效提高少弱精症模型大鼠精子特异性钙通道Cat Sper1、Cat Sper2基因及其蛋白的表达。

“生精散”对大鼠睾丸扭转复位后生精功能的影响及其机制研究

目的:研究"生精散"对大鼠睾丸扭转复位后生精功能的影响及其机制。方法:40只雄性SD大鼠随机分为假手术组(A组),对照组(B组),生精散组小(C组)、中(D组)、大剂量组(E组),每组8只。建立左侧睾丸扭转模型,B组自扭转前1 h开始给予每日灌胃生理盐水1 ml/d,C组(0.01 g/kg.d)、D组(0.02 g/kg.d)、E组(0.03 g/kg.d)分别按体重给予灌服生精散,连续35 d后处死大鼠,对大鼠进行精液常规分析,用RT-PCR检测大鼠精子CatSper1的表达。结果:a+b级精子百分率、精子存活率、精子浓度,CatSper1基因表达,与A组[(51.30±6.60)%、(69.01±7.20)%、(40.53±7.01)×106/ml、2.04±0.77]相比,B组[(15.30±6.30)%、(44.42±6.36)%、(21.00±6.14)×106/ml、1.12±0.50),均显著降低(P<0.01);与B组相比,D组[(51.63±3.20)%、(72.09±2.20)%、(55.30±5.90)×106/ml、2.11±0.20]、E组[(55.93±3.17)%、(73.01±2.11)%、(58.33±4.90)×106/ml、2.31±0.17]均显著升高(P<0.01),而C组[(18.02±0.23)%、(48.04±7.01)%、(22.87±2.10)106/ml、1.19±0.51]升高不明显(P>0.05)。结论:生精散可以促进睾丸扭转复位后精子质量的恢复,其机制可能与调节生精功能,提高精子细胞CatSper1基因的表达有关。

补肾益精汤对弱精症大鼠精子线粒体功能的影响及其相关机制研究

目的:研究补肾益精汤对大鼠精子线粒体呼吸功能及能量代谢的影响,并从基因水平分析其可能的相关机制。方法:随机数字表法将100只SD雄性大鼠分为正常对照组(A组)、雷公藤多苷组(B组)、生理盐水组(C组)、左卡尼汀组(D组)及补肾益精汤组(E组),每组20只。A组大鼠每日灌胃生理盐水[1 mL/(kg·d)],B、C、D、E组每日灌胃雷公藤多苷[20 mg/(kg·d)],共21 d,处死A、B两组大鼠,然后C组每日灌胃生理盐水[1 mL/(kg·d)],D组每日灌胃左卡尼汀[50 mg/(kg·d)],E组每日灌胃补肾益精汤[3 g/(kg·d)],共35 d,处死C、D、E三组大鼠。获取各组大鼠精液标本,检测精液精子运动参数、细胞线粒体呼吸控制率(RCR)及精子细胞ATP含量,同时检测各组精子细胞特异性钙通道CatSper1基因含量,分析E组RCR、ATP分别与CatSper1 RNA含量的相关性。结果:与A组比较,B组的精子密度、a+b级百分率及存活率均明显下降(P<0.01)。与C组比较,D组、E组a+b级精子百分率明显提高(P<0.01)。RCR、ATP含量及CatSper1 RNA均提高。D、E组的精子RCR分别为(4.39±0.42 vs 5.15±0.39)μmol·min^-1·g^-1,ATP含量分别为(4.02±0.50 vs 5.82±0.40)μg/g,CatSper1 RNA分别为(2.18±0.28 vs 2.64±0.28)ng/μL,差异均具有统计学意义(P<0.01)。E组大鼠的RCR、ATP含量与CatSper1 RNA均呈正相关(r=0.912、0.893,P<0.05)。结论:雷公藤多苷可成功制备弱精子症大鼠模型;补肾益精汤可明显提高弱精症大鼠的精子活动力,增加其精子呼吸功能及能量代谢,其机制可能与增加特异性钙通道CatSper1 RNA基因的表达有关。

中药复方调节模型大鼠精子尾部特异性钙通道

目的:研究中药复方"促育生精方"对环磷酰胺诱导的少弱精模型大鼠精子Catsper1、Catsper2基因及蛋白表达的影响,并探讨其调节机制。方法:采用实时荧光PCR法检测Catsper1 mRNA、Catsper2 mRNA在各组大鼠(随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、空白对照组)精子中的表达;用蛋白印迹法检测各组Catsper1,Catsper2蛋白的表达。结果:Catsper1 mRNA、Catsper2 mRNA表达量为:中、高剂量组显著高于模型组(P<0.05)。Catsper1、Catsper2蛋白表达量:中、高剂量组显著高于模型组(P<0.05)。结论:促育生精方能有效提高少弱精症模型大鼠精子特异性钙通道Catsper1、Catsper2基因及其蛋白的表达。

益肾通络补气方对弱精子症模型大鼠生殖功能损伤的保护机制研究

目的 研究益肾通络补气方对弱精子症模型大鼠生殖功能损伤的保护机制。方法 采用雷公藤多苷制备弱精子症大鼠模型,通过计算机辅助精子分析系统观察益肾通络补气方对精子前向运动精子百分率(PR)、精子总活力(PR+NP)、浓度等精液分析指标的影响。实验动物按体重随机分为正常对照组、雷公藤多苷组、益肾通络补气方高、中、低剂量组,每组7只。正常对照组每日给予正常饮食,共42 d;雷公藤多苷组每日灌胃雷公藤多苷20 mg/kg,共4周;益肾通络补气方低[0.3 g/(只·d)]、中[0.6 g/(只·d)]、高[1.2g/(只·d)]剂量组灌胃益肾通络补气方,共14天。结果 雷公藤多苷组大鼠精子前向运动精子百分率(PR)、精子总活力(PR+NP)、浓度等功能指标均较正常对照组和生理盐水组显著降低。睾丸组织HE染色显示雷公藤多苷组大鼠生精小管内各级精母细胞和精子细胞数明显减少、生精细胞排列紊乱。益肾通络补气方高、中、低剂量组均可显著提高模型大鼠精子前向运动精子百分率(PR)、精子总活力(PR+NP)、浓度等。结论 雷公藤多苷可以诱导稳定的弱精子症大鼠模型,益肾通络补气方具有提高弱精子症大鼠精子的前向运动精子百分率、精子总活力、浓度的作用,雷公藤可以显著降低大鼠精子特异性钙通道CatSper1的表达,而益肾通络补气方可以上调弱精子症大鼠CatSper1的表达。