猪Cathepsin B基因cDNA分子克隆、序列分析及遗传多态性分析

采用RT-PCR结合克隆测序的方法,从猪肌肉组织总RNA中克隆出了猪组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)基因的cDNA序列,并推导出其编码的氨基酸序列。猪CTSB基因开放阅读框(ORF)全长1008 bp,编码335个氨基酸。同源性分析结果表明,猪与人、鼠、牛的CTSB基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为85%、81%、90%,推测的氨基酸序列同源性分别为81%、79%、91%。利用同源性结合序列特征预测表明该蛋白具有信号肽和前肽序列。蛋白质结构同源建模分析表明,该蛋白具有木瓜蛋白酶家族的典型空间结构,包括1个底物结合凹槽和3个相互靠近的活性位点。另外采用PCR-SSCP方法,在147头个体中分析了CTSB基因第6内含子内的SS-CP位点多态性,检测到3个等位基因6种基因型。FF基因型个体的各项嫩度指标最高,其最大剪切力与硬度值分别为6.56 kg和23.55 kg.s,极显著地高于EE和EF基因型个体(P<0.01),平均剪切力为4.85 kg,显著地高于EF基因型个体(P<0.05)。

猪Cathepsin B基因和Cystatin B基因mRNA表达的发育性变化及组织差异

【目的】研究猪肉嫩度性状候选基因-组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)和半胱氨酸蛋白酶抑制素B(cystatin B,CSTB)在体内不同组织、不同发育阶段的表达变化规律,为研究嫩度性状的遗传调控机理提供依据。【方法】采用荧光探针RT-PCR,定量分析CTSB和CSTB mRNA在两个品种猪的多个组织、多个发育时间点的表达量。【结果】RT-PCR结果表明,CTSB和CSTB mRNA表达量最高的组织为肾脏,心肌和骨骼肌中表达丰度低,股四头肌CSTB mRNA表达量极显著高于背最长肌。CTSB mRNA表达量在0～5月龄长白猪和梅山猪背最长肌中表现出先升高后降低的变化趋势,梅山猪峰值出现较早,并在4月龄后再次出现急剧上升。CSTB mRNA表达量在梅山猪中表现出生初期较高,随后逐渐降低的表达模式,长白猪的表达模式则为出生后表达量急剧升高,2月龄达到峰值,随后逐渐降低。2品种猪背最长肌组织CTSB和CSTB mRNA表达量表现出显著正相关。【结论】CTSB和CSTB mRNA表达量受到组织、发育阶段和品种影响,2基因mRNA表达量呈显著正相关。

Cystatin M,Cathepsin B双基因共表达载体的构建及鉴定

目的:构建半胱氨酸蛋白酶抑制剂M(Cystatin M,CST6),反义组织蛋白酶B(CB)单/双基因共表达载体.方法:从人胎盘组织中用TRIzol试剂提取总RNA,巢式PCR扩增人Cystatin M基因全长cDNA片段,RT-PCR扩增CB基因cDNA片段.将扩增的Cystatin M插入到真核表达载体pBudCE4.1的HindⅢ位点上,将CB插入到带有及不带Cystatin M基因真核表达载体pBudCE4.1的XhoI位点上.构建pBudCE4.1/CST6,pBudCE4.1/CB单基因表达载体及pBudCE4.1/CST6-CB双基因共表达载体.利用PCR、酶切分析和序列测定方法进一步验证所构建质粒的准确性.结果:人CST6,CB的RT-PCR扩增产物片段大小分别为447,257bp.对pBudCE4.1/CST6,pBudCE4.1/CB,pBudCE4.1/CST6-CB进行测序分析证实CST6,CB序列均正确,酶切鉴定及PCR结果显示,CST6,CB的大小分别为447,257bp且已克隆至pBudCE4.1中.结论:成功构建了pBudCE4.1/CST6,pBudCE4.1/CB,pBudCE4.1/CST6-CB表达载体,为深入探讨2种基因在肿瘤侵袭中的生物学作用机制奠定了基础.

Cathepsin B反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞中CB mRNA表达的影响

目的:探讨组织蛋白酶B(CB)反义寡核苷酸(ASODN)对CB mRNA表达的影响。方法:将食管癌EC9706细胞分5组培养,5组分别用设计合成的3条封闭CB不同基因位点的反义寡核苷酸(ASODN1、ASODN2、ASODN3)及1条无关寡核苷酸(N-ODN)转染,另1组不转染(空白对照组)。采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中CB mRNA表达情况。结果:3条CB ASODNs转染的EC9706细胞中CB mRNA表达均下调,差异无统计学意义,但均明显低于N-ODN组及空白对照组。结论:CB ASODN可抑制食管癌EC9706细胞中CB mRNA表达,为临床预防食管癌等恶性肿瘤浸润转移奠定理论了基础。

Cathepsin B基因的沉默对香蕉穿孔线虫繁殖力的影响

【目的】通过研究cathepsin B基因对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)繁殖力的影响,探索cathepsin B基因的功能,为利用该基因防治香蕉穿孔线虫和植物寄生线虫组织蛋白酶的进一步研究提供科学依据。【方法】根据已知香蕉穿孔线虫cathepsin B基因(Rs-cb-1)的序列,从香蕉穿孔线虫克隆cathepsin B基因,以含有目的基因的质粒DNA为模板合成特异的双链RNA(dsRNA),采用dsRNA浸泡的方法对香蕉穿孔线虫进行RNA干扰(RNAi)试验,通过室内接种胡萝卜愈伤组织繁殖线虫的方法,研究cathepsin B基因的沉默效应对香蕉穿孔线虫繁殖力的影响。【结果】用Rs-cb-1dsRNA浸泡12、24、48、72h后香蕉穿孔线虫的平均繁殖倍数分别为165、93、54、53,而未经dsRNA处理的该线虫繁殖倍数均大于420;并且Rs-cb-1dsRNA浸泡的时间不同,对应各处理之间的繁殖倍数差异显著。RT-PCR检测,经Rs-cb-1dsRNA浸泡12h后,目的基因在香蕉穿孔线虫的表达量明显减弱,浸泡24h后其表达量进一步减弱,但还有微量表达,经dsRNA浸泡48、72h后目的基因基本不表达。【结论】Rs-cb-1与香蕉穿孔线虫的繁殖力相关;Rs-cb-1dsRNA的浸泡可以明显抑制cathepsin B基因的表达量,从而影响香蕉穿孔线虫的繁殖力,但浸泡时间不同Rs-cb-1的沉默效率也不同,沉默效率最好的干涉时间是48h。

日本囊对虾Cathepsin B基因在不同卵巢发育时期的表达

采用实时定量PCR技术,以18SrRNA为内标基因,检测日本囊对虾Cathepsin B基因在mRNA水平不同卵巢发育时期的表达。结果显示,Cathepsin B在卵黄合成前期表达最高,内源性卵黄合成期和外源性卵黄合成期表达水平基本一致,而在成熟期表达水平急剧下降。其中卵黄合成前期与其它3期相比具有显著性差异(P<0.05),内源性卵黄合成期和外源性卵黄合成期Cathepsin B不具有显著性差异(P>0.05),而成熟期与前边三期相比具有显著性差异(P<0.05)。推测Cathepsin B可能在日本囊对虾卵巢发育中发挥了作用。

烟夜蛾组织蛋白酶B酶原基因的克隆、序列分析和原核表达

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术从烟夜蛾Helicoverpa assulta(Guene)雌虫卵巢中扩增得到了组织蛋白酶B酶原基因(cathepsin B,CB)cDNA片段,将其克隆至pMD19-T载体。测序结果表明,该片段长度为1017bp,含有组织蛋白酶B酶原基因完整开放阅读框架(ORF)(Gen Bank登录号:EF154237)。序列分析结果显示:烟夜蛾组织蛋白酶B(HassCB)编码338个氨基酸残基,预测N-末端含有长度为21个氨基酸残基的信号肽序列;去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为35.5kDa,等电点为5.96。氨基酸序列比对结果表明,HassCB与其他昆虫的组织蛋白酶B酶原氨基酸序列有较高的一致性。将去除信号肽序列的HassCB(HassCBa)重组到表达载体pGEX-4T-1中,并转入原核细胞中表达,SDS-PAGE和Western印迹分析表明:该基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61kDa的目的条带,与预测的融合蛋白分子量相符。用该基因制备多克隆抗体并测得该抗体对重组表达的HassCBa的效价为1∶51200。通过免疫印迹检测证实,此抗体既能识别重组表达的HassCBa,又能识别烟夜蛾卵巢匀浆液中的HassCB。

亚硝酸盐胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化酶、热休克蛋白和组织蛋白酶B基因表达量的影响

用实时荧光定量PCR技术研究在20 mg/L亚硝酸盐胁迫下,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和硫氧还蛋白(TRx)等抗氧化相关酶以及热休克蛋白HSP70、组织蛋白酶B(CTSB)的基因表达量变化。结果表明,与对照组相比,在胁迫24 h时Mn-SOD基因表达量显著升高,CAT基因表达量在12~48 h升高,GPx基因表达量在24和48 h时升高,TRx基因表达量24 h时升高,而后在48和72 h时降低,Hsp70基因表达量在48和72 h时升高,CTSB基因表达量在48 h和72 h时升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。在亚硝酸盐胁迫下,抗氧化酶相关基因、Hsp70和CTSB基因的表达量均被显著诱导进行免疫防御,4种抗氧化相关基因和Hsp70、CTSB基因对亚硝酸盐胁迫敏感度不同,在抗亚硝酸盐胁迫过程中有一定协同作用。

组织蛋白酶B研究进展

组织蛋白酶B(cathepsinB:EC3.4.22.1)是溶酶体内半胱氨酸内切蛋白水解酶,其作用非常广泛,参与机体多种生理、病理过程.尤为重要的是,它能促进肿瘤细胞浸润转移,因此成为目前诊断、治疗恶性肿瘤的研究热点.综述了组织蛋白酶B的生物学特性、基因与蛋白结构特点、表达调控机制,以及应用方面的研究.

组织蛋白酶B及其基因在肝癌中的表达及意义

目的 :检测人原发性肝细胞癌 (HCC)组织中组织蛋白酶B(cathepsinB ,CB)和CBmRNA的表达 ,探讨其机制与作用。方法 :应用免疫组织化学和原位杂交方法测定 71例肝组织标本 ,包括对照组 (C) 12例 ,HCC组 34例和肝细胞肝癌癌旁组织组 (PTT) 2 5例CB蛋白和CBmRNA的表达 ,采用吸光度值分析其相对含量。结果 :HCC组CB蛋白和CBmRNA的平均吸光度值均明显高于C组和PTT组 ,差异有显著性 (P均 <0 .0 1) ,PTT组与C组间两指标差异均无显著性 (P均 >0 .0 5 )。结论 :人肝细胞肝癌组织CB蛋白和CBmRNA均呈现高表达。CB可能是反映原发性肝细胞肝癌发生、发展的重要标记物之一 ,并参与肝癌的侵袭与转移。

原发性乳腺癌组织蛋白酶B和Cystatin M的表达

目的分析乳腺癌中组织蛋白酶B和CystatinM的表达及其与肿瘤侵袭转移的关系,探讨组织蛋白酶B和抑制剂cystatinM在乳腺癌侵袭转移的作用。方法应用免疫组织化学SP法结合图像分析技术,检测70例乳腺癌组织的组织蛋白酶B和cystatinM蛋白表达,并分析其与肿瘤大小、组织学分级、临床分期、腋淋巴结转移和雌孕激素受体状况等临床病理特征之间的关系。结果乳腺癌组及对照组的组织蛋白酶B和cystatinM蛋白阳性表达率分别为77·1%(54/70)、46·7%(7/15);51%(36/70)、80·0%(12/15)。乳腺癌组的组织蛋白酶B和cystatinM蛋白平均表达强度D值分别为0·382±0·030和0·300±0·021,与对照组(0·349±0·026和0·347±0·024)比较,差异有统计学意义(P<0·01),其中组织蛋白酶B与cystatinM的表达呈负相关(r=-0·286,P<0·05)。有腋淋巴结转移的乳腺癌组,其组织蛋白酶B蛋白表达强度高于无腋淋巴结转移组(D:0·397±0·036和0·380±0·032);而其cystatinM的表达低于无腋淋巴结转移组(0·289±0·026和0·303±0·022),差异有统计学意义(P<0·05)。临床分期高的乳腺癌组织蛋白酶B的表达高于临床分期低组(D:0·390±0·029、0·375±0·025和0·357±0·026);其cystatinM的表达则低于临床分期低组(D:0·279±0·025、0·293±0·024和0·313±0·027),差异有显著性(P<0·05)。组织蛋白酶B与cystatinM的表达与肿瘤大小、组织学分级及雌、孕激素受体状况之间无明显相关性。结论乳腺癌中存在组织蛋白酶B和cystatinM的表达失衡与肿瘤侵袭转移有关。

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)组蛋白酶B基因克隆及其在组织和卵巢发育过程中的表达

组蛋白酶B广泛存在于生物体内,与免疫、消化和繁殖等生理功能息息相关。为了研究组蛋白酶B在甲壳动物体内的作用尤其在卵巢发育过程中的作用,本研究采用3’RACE和5’RACE技术,首次克隆获得日本沼虾(Macrobrachium nipponense)组蛋白酶B(简称Mn CB)基因c DNA全长,并采用实时荧光定量(q PCR)测定了Mn CB在日本沼虾不同组织中和卵巢发育过程中m RNA的表达量。序列结果分析表明:Mn CB序列含有12 bp的5’-UTR,996 bp的ORF和702 bp的3’-UTR。ORF共编码331个氨基酸的多肽,此多肽由16个氨基酸的信号肽、63个氨基酸的前导肽和252个氨基酸的成熟肽组成,其理论p I为6.36,分子量为36.5KDa。q PCR的结果表明:Mn CB在测定的所有组织中均有表达,在心脏中表达量最高,肌肉、肝胰腺和胸神经节中表达量中等,肠、鳃和血细胞中的表达量较低。Mn CB的表达量在卵巢的发育过程中逐步升高,卵巢发育至初级卵黄发生期(Ⅲ期)Mn CB的表达量显著增加(P<0.05),次级卵黄发生期(Ⅳ期)表达量继续增加,并增至最大值,Ⅳ期与Ⅲ期表达量差异不显著(P>0.05),成熟期(V期)表达量显著下降(P<0.05)。上述研究结果表明Mn CB广泛存在于日本沼虾的组织中,并且参与卵黄蛋白原或卵黄蛋白的水解。

草地贪夜蛾组织蛋白酶B的基因克隆、序列分析、三维结构预测及其分子对接模拟

昆虫组织蛋白酶B(Cathepsin B)在昆虫发育和代谢过程中发挥重要作用。本研究首先克隆了草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smmith)的组织蛋白酶B基因Cathepsin B(SCB),获得其开放阅读框(ORF)序列(Gen Bank登录号:HQ110064)。生物信息学分析表明,该基因的开放阅读框包含1 026 bp的片段,编码341个氨基酸,预测N-末端含有长度为20个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为35.6 k D,等电点为6.59。氨基酸序列与15种物种Cathepsin B比较有51.2%-96.2%的一致性,与甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hiibner)相似度最高,达96.2%。利用同源建模预测SCB的三维结构,经动力学的优化,SCB折叠成紧密而稳定的球状结构,含6个对结构有稳定作用的二硫键,亲水性氨基酸主要包被在蛋白表面。同时分子对接模拟结果表明,SCB结合口袋比较浅,形状不规则,袋口较宽。ARG19、VAL23和ASN24为活性位点关键氨基酸残基,抑制剂CA与SCB活性位点3个关键氨基酸残基有较强的相互作用,且均主要表现为静电相互作用能,其中VAL23、ASN24与CA形成氢键。以期为进一步运用生物实验手段研究Cathepsin B的结构和功能,设计和开发昆虫组织蛋白酶类抑制剂类杀虫剂奠定基础。

胃癌组织中c-erb B-2和组织蛋白酶D的表达及其与胃癌生物学行为间的关系

目的 观察癌基因c erbB 2及组织蛋白酶D(Cath D)在胃癌中的表达 ,探讨二者的关系及其与胃癌生物学行为之间的关系。方法 采用免疫组化S P法检测了 10 2例胃癌手术切除标本的c erbB 2及Cath D的表达 ,同时观察了网状纤维分布与c erbB 2和Cath D之间的关系 ,并将检测结果与跟踪随访资料进行了综合分析。结果 10 2例胃癌组织中c erbB 2表达阳性率为 3 8.2 4% (3 9/ 10 2 ) ,与胃癌浸润深度 (P<0 .0 5 )及淋巴结转移 (P<0 .0 5 )密切相关 ;Cath D表达阳性率为 81.3 7% (83 / 10 2 ) ,与胃癌浸润深度 (P<0 .0 5 )、生长方式 (P<0 .0 5 )、淋巴结转移 (P<0 .0 5 )及脉管内有无癌栓 (P<0 .0 5 )有关。生存期分析显示 :Cath D和c erbB 2表达阳性患者预后差 ,5年生存率低于表达阴性患者。结论 c erbB 2及Cath D与胃癌的生长、浸润、转移及预后有密切关系 ,可作为判断胃癌生物学行为和预后的重要指标 ,为临床诊断。

香蕉穿孔线虫组织蛋白酶B基因的克隆与分析

为了获得香蕉穿孔线虫的组织蛋白酶B基因,分析该基因的序列、结构及其功能,为进一步研究植物寄生线虫组织蛋白酶的功能及其在线虫防治中的应用提供科学依据。我们应用SMART技术构建了香蕉穿孔线虫cDNA文库;采用SL法,克隆得到香蕉穿孔线虫组织蛋白酶B基因全长cDNA,通过测序获得1 257bp全长序列,命名为Rs-cb-1(GenBank:GU360972),该基因cDNA全长序列包括1 071bp的完整ORF,编码356个氨基酸,蛋白质相对分子质量为41 400。对该基因的序列结构及其编码的蛋白2级结构和三维结构与功能进行分析和预测结果表明,Rs-cb-1序列与其他寄生虫的组织蛋白酶B基因序列相比,该基因与秀丽小杆线虫组织蛋白酶B基因的亲缘关系最近;其编码蛋白主要为细胞外分泌蛋白,定位于微体(过氧化物酶体)、内质网膜和内质网管腔上,约有25个氨基酸跨膜区段位于蛋白质的C端,其表面电荷呈明显的极性分布;另外,通过同源建模获得该蛋白的三维结构预测图,这些结构与已报道的组织蛋白酶B生物学功能相符。本研究分离克隆得到的Rs-cb-1,是首个分离克隆得到的香蕉穿孔线虫组织蛋白酶B基因,从而为该线虫组织蛋白酶的进一步研究奠定了基础。

大珠母贝组织蛋白酶B基因克隆及其表达分析

【目的】分析组织蛋白酶B基因(CatB)在大珠母贝(Pinctada maxima)不同组织中的表达模式,明确CatB在大珠母贝中的功能作用,为培育生长快且抗逆性强的大珠母贝提供基础资料。【方法】利用RACE克隆大珠母贝CatB基因,利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL及SignalP 4.1等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝外套膜(套膜区、边缘膜区和中央膜区)、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织中的表达情况。【结果】大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp,其开放阅读框(ORF)1026 bp,5'非编码区(5'-UTR)长度81 bp,3'非编码区(3'-UTR)长度258 bp,共编码341个氨基酸残基。大珠母贝CatB蛋白分子量为37.73 kD,理论等电点(pI)为6.66,脂溶性系数为67.48,不稳定指数为31.18,亲水性平均系数(GRAVY)为-0.451,为稳定的亲水性蛋白;在第89~337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域。大珠母贝CatB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占51.03%,α-螺旋占26.98%,β-转角占9.09%,延伸链占12.90%;三级结构与马氏珠母贝(P.fucata martensii)CatB蛋白结构相似。大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列(ADX32985.1)的相似性高达90.91%;与长牡蛎(Crassostrea gigas,XP_011428258.1)、海湾扇贝(Argopecten irradians,ANG56311.1)、褶纹冠蚌(Cristaria plicata,AEF32260.1)的CatB氨基酸序列相似性分别为79.47%、65.38%和62.18%。CatB基因在大珠母贝外套膜的套膜区、边缘膜区和中央膜区及肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等7个组织中均有表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05),其次是外套膜的套膜区和中央膜区。【结论】CatB基因在大珠母贝肝胰腺中高表达,其次是外套膜的套膜区和中央膜区,故推测CatB是通过参与大珠母贝的消化吸收作用而调控其生长代谢过程。

线虫脂肪沉积中组织蛋白酶B的表达及功能研究

文章利用高糖/高胆固醇饮食诱导了线虫,油红O染色结果表明线虫脂肪沉积显著增加。为了研究组织蛋白酶B在诱导线虫过程中的作用,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)研究了组织蛋白酶B同源基因的表达。选取其中的关键基因利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,研究其在线虫脂肪沉积中的作用。结果表明:在线虫脂肪沉积改变后,组织蛋白酶B同源基因表达随之改变;而利用RNA干扰组织蛋白酶B关键基因cpr-3的表达,线虫的脂肪沉积未受影响。因此,组织蛋白酶B同源基因可能参与线虫脂肪沉积改变后的生理变化,而未直接参与线虫脂肪沉积的调控。

烟草组织蛋白酶B基因的结构特征分析及mRNA表达

为了明确烟草中组织蛋白酶B基因的功能,对烟草组织蛋白酶B基因(NbCathB)进行了序列分析。该基因ORF长951 bp,编码316个氨基酸。该基因蛋白质的预测分子量为35.2 kD,等电点为6.14。对NbCathB的基因结构分析显示,该基因具有8个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。比较NbCathB和AtCathB基因,显示两者编码氨基酸序列一致性为61%。通过SMART软件分析,NbCathB和AtCathB基因的结构域很相似。在上清液、菌体、菌液以及水4种处理烟叶中的表达谱鉴定显示,在喷施MP制剂(巨大芽孢杆菌)菌体和菌液的烟叶中NbCathB的表达量明显高于在喷施MP制剂上清液的烟叶中的表达量,而在喷施水的烟叶中的表达量最低。说明NbCathB很可能发挥了AtCathB相同的作用。

组织蛋白酶B通过瞬时受体电位黏蛋白-1对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体活化的影响

目的探索在细胞氧化应激模型和特异性基因沉默细胞模型中,组织蛋白酶B(CTSB)通过瞬时受体电位黏蛋白-1(TRPML1)对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体活化的影响。方法对体外培养的BV2细胞分别用H2O2、钙敏感性受体激动剂GdCl3、CTSB抑制剂CA-074Me单独或同时处理,用酶联免疫吸附实验方法检测白细胞介素-1β(IL-1β)和半胱天冬酶-1-蛋白;用定量PCR方法检测各组BV2细胞的NLRP3mRNA。用MTT法检测各组BV2细胞生长活力。用定量PCR方法检测BV2细胞中胱抑素C和TRPML1的mRNA,用Westernblot检测TRPML1、CTSB、组织蛋白酶D(CTSD)、组织蛋白酶L(CTSL)、组织蛋白酶V(CTSV)蛋白。针对TRPML1基因靶序列设计特异性小干扰RNA(siRNA),在BV2细胞中建立TRPML1基因沉默细胞株(命名为Tr-si-BV2细胞),通过H2O2处理,再用Westernblot检测Tr-si-BV2细胞或对照组细胞中的TRPML1、CTSB和转录因子EB(TFEB)蛋白。结果用H2O2处理后,BV2细胞中半胱天冬酶-1蛋白和NLRP3mRNA表达增加,加用GdCl3处理后,BV2细胞中IL-1β显著增加(P=0.0036);使用CA-074Me处理后,NLRP3mRNA(P=0.037)、半胱天冬酶-1(P=0.021)、IL-1β(P=0.036)均显著减少。H2O2组和H2O2+GdCl3组的细胞生长较慢。在H2O2浓度为200μmol/L的处理组,BV2细胞中CTSBmRNA与TRPML1mRNA、或CTSB与TRPML1蛋白的表达均有相似的变化;沉默TRPML1基因表达水平后能够抑制H2O2诱导的CTSB蛋白表达。组织蛋白酶CTSD、CTSL、CTSV的变化不受H2O2处理浓度高低的影响。在进行TRPML1基因沉默处理的BV2细胞中,H2O2+siRNA处理组与H2O2处理组比较,CTSB蛋白的表达显著减少(P=0.021)。结论在小胶质细胞的氧化应激模型中,CTSB具有调节NLRP3炎症小体活化的作用,这种作用有可能通过钙离子通道蛋白TRPML1介导。

日本囊对虾组织蛋白酶B基因的原核表达及纯化

采用原核表达的方法得到日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)组织蛋白酶B基因的重组蛋白。以日本囊对虾卵巢组织为试验材料,采用双标签(GST和His)的方法,用带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点以及6×His-tag的特异引物扩增Cathepsin B的开放阅读框,并连接至表达质粒pGEX-4T-2中。将重组表达质粒导入大肠杆菌BL21中,在30℃条件下,用终浓度为1mmol/L的IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导5h得到最佳诱导量,His亲和柱进行纯化,纯化蛋白依次于8、6、4、2、1、0 mol/L尿素缓冲液中梯度透析,得到复性后可溶于水的重组蛋白,经SDS-PAGE检测,得到单一条带,其分子质量约为63ku。取冻干后的蛋白制备多克隆抗体,抗体效价达50 000,经Western blot检测,同样可在63ku处得到该条带,表明制备的组织蛋白酶B(CB)多克隆抗体具有特异性,该抗体可特异识别CB蛋白。