苯妥英抑制心脏Cav1.2通道合成与转运的机制研究

目的:探讨抗癫痫药物苯妥英(PHT)对心肌细胞(CMs)中L型钙通道(Cav1.2)蛋白合成和转运的影响。方法:对无特定病原体(SPF)级雄性Sprague-Dawley(SD)乳鼠的原代CMs分别使用不同浓度的PHT(0μg/mL、0.0001μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL)干预24 h和48 h,采用CellTiter-Glo法检测细胞活性。采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)和激光扫描共聚焦显微镜分别观察PHT对原代CMs中Cav1.2通道蛋白合成和转运的影响。结果:在CellTiter-Glo细胞活性检测中,随着苯妥英浓度的增加,除100μg/mL组干预48 h后细胞存活率降低至85.23%(P<0.05)外,其余各组间细胞活性比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。Western Blot结果显示,100μg/mL苯妥英干预原代CMs时Cav1.2合成明显受到抑制,然而激光扫描共聚焦显微镜结果提示在10μg/mL苯妥英干预原代CMs时已出现Cav1.2转运障碍。结论:苯妥英可抑制心脏Cav1.2的合成和转运,可能与其可致心律失常作用相关,临床上在应用苯妥英时应仔细评估病人情况,尽可能减少副作用的产生。

舒郁胶囊及其主要组份对经前期综合征肝气郁证大鼠海马中Cav1.2介导的CaM/CaMKⅡ信号通路的影响

目的探讨L型钙通道(Cav1.2)下游信号通路中钙调蛋白/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(Ca M/CaMKⅡ)与经前期综合征(PMS)肝气郁证的关系以及舒郁胶囊的干预机制。方法用舒郁胶囊、柴胡提取物、白芍提取物和阳性对照氟西汀+尼莫地平对慢性束缚应激法制备的PMS肝气郁证大鼠进行干预,免疫印迹技术检测各组海马中CaM,CaMKⅡ的磷酸化水平及脑源性营养因子(BDNF)蛋白表达。结果慢性束缚应激可以成功复制PMS肝气郁证大鼠模型。蛋白表达结果显示,模型组大鼠海马中Ca M蛋白的表达量升高(P<0.05),CaMKⅡ磷酸化水平显著升高,BDNF蛋白的表达量显著下降(P<0.01)。与模型组相比,氟西汀+尼莫地平组大鼠海马CaM蛋白表达量显著降低(P<0.05),各给药组海马中CaMKⅡ磷酸化水平显著下降(P<0.01),BDNF的蛋白表达量均显著升高(P<0.01,P<0.05)。结论海马脑区Cav1.2下游信号通路中CaM/CaMKⅡ的激活与PMS肝气郁证的发生有关,舒郁胶囊及其有效组分可能是通过抑制CaMKⅡ信号通路的激活发挥其治疗作用。

钙离子在牙釉质矿化中的作用

牙釉质的矿化形成是一个信号分子贯穿始终的过程,釉质矿化通过细胞内多种离子与信号通道的紧密调节和上皮与间充质的相互作用,最终使牙釉质成为人体中矿化程度最高、最硬的组织。Ca^(2+)作为细胞内重要的第二信使分子,在生物矿化中调节许多过程,其中就包括调节釉质蛋白的表达。在牙釉质的基本结构羟基磷灰石晶体中,约含有60%质量的Ca^(2+),由此可见Ca^(2+)是牙釉质的关键和必需成分。因此,Ca^(2+)的正常转运在牙釉质矿化过程中起着关键作用。

PKCα/Ca_V1.2在有氧运动改善高血压肠系膜动脉功能中的作用

目的:探究蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)与L型电压门控钙离子通道(voltage-gated L-type Ca^2+channel,CaV1.2)之间的关系,以及PKCα/CaV1.2信号通路在有氧运动改善自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)肠系膜动脉功能中的作用。方法:12周龄雄性SHR和正常血压大鼠(Wistar-Kyoto,WKY)随机分为有氧运动组(SHR-EX、WKY-EX)和安静对照组(SHR-SED、WKY-SED),运动组进行12周中等强度的跑台运动。12周后,取各组肠系膜动脉,采用离体微血管环张力测定血管收缩特性变化及PKCα/CaV1.2信号通路在血管张力调节中的作用;酶消化急性分离肠系膜动脉平滑肌细胞,膜片钳全细胞模式记录CaV1.2通道电流及PKCα对CaV1.2通道电流的影响;免疫荧光观察平滑肌细胞PKCα、CaV1.2通道α1C亚基表达、分布及二者共定位分析。结果:1)有氧运动可显著降低高血压大鼠体重、心率和血压(P<0.05);2)高血压时,肠系膜动脉对CaV1.2通道激动剂BayK8644、抑制剂Nifedipine的敏感性显著增加(P<0.05),而有氧运动可有效抑制高血压大鼠对BayK8644、Nifedipine的敏感性增加(P<0.05);3)PKCα抑制剂Gö6976可诱使血管舒张,SHR-SED组对Gö6976的敏感性显著高于WKY-SED组(P<0.05);与SHR-SED组相比,SHR-EX组肠系膜动脉对Gö6976的敏感性显著降低(P<0.05),但WKY-EX组与WKY-SED组间无显著性差异(P>0.05);4)PKC激动剂PDBu可诱导血管张力呈浓度依赖性增加,而预先孵育Gö6976抑制PKCα作用后,PDBu诱发的各组肠系膜动脉收缩反应降低。同时,与其各自的安静对照组相比,WKY-EX组、SHR-EX组对PDBu诱发的收缩反应均无显著性差异(P>0.05),加入Nifedipine后各组血管舒张程度也变小,运动组与其安静组相比,其血管张力变化均无显著性差异(P>0.05);5)Gö6976可诱使各组CaV1.2通道电流幅值减小。其中,与WKY-SED组相比,SHR-SED组CaV1.2通道电流降低幅度显著增高(P<0.05),而有氧运动显著抑制了高血压肠系膜动脉CaV1.2通道对Gö6976的反应(P<0.05);WKY-SED组与WKY-EX组间CaV1.2通道电流降低幅度无显著性差异(P>0.05);6)免疫荧光结果显示,高血压时PKCα信号表达及其与CaV1.2通道α1C亚基共定位比率显著上调,而有氧运动有效地抑制了其上调(P<0.05)。结论:有氧运动可有效降低SHR体重、心率和血压,抑制高血压诱导的PKCα表达上调,从而调节CaV1.2通道功能,改善高血压,即有氧运动可通过抑制PKCα/CaV1.2信号通路表达上调来改善高血压大鼠肠系膜动脉舒缩功能。

山奈酚对缺氧/复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探究山奈酚对缺氧/复氧损伤诱导心肌细胞凋亡的影响和机制。方法:利用随机数字法将H9C2大鼠心肌细胞随机分为三组,对照组细胞在常规孵箱培养,缺氧/复氧组细胞利用缺氧孵箱和常规孵箱交替培养,山奈酚组细胞在缺氧/复氧培养的基础上应用30μmol/L山奈酚。分别利用流式细胞仪和多核苷酸链断裂技术检测各组细胞凋亡水平,利用蛋白印迹技术检测凋亡相关蛋白和钙离子通道蛋白含量,利用免疫荧光技术检测细胞中钙离子浓度。结果:和对照组比较,缺氧/复氧组细胞凋亡增加,钙离子通道蛋白Cav1.2表达和细胞中钙离子含量增加(均P<0.05);和缺氧/复氧组比较,山奈酚组细胞凋亡减少,钙离子通道蛋白Cav1.2表达和胞内钙离子浓度减少(均P<0.05)。结论:山奈酚可能通过减少钙离子通道蛋白Cav1.2表达和胞内钙离子浓度抑制缺氧/复氧损伤诱导的大鼠心肌细胞H9C2凋亡。

CSL与CaV 1.2钙通道N末端的相互结合作用

目的探讨钙蛋白酶抑素结构域L(CSL)与CaV1.2钙通道N末端(NT)之间的相互结合作用。方法利用I-TASSER同源建模服务器,对豚鼠CaV 1.2钙通道N末端和人源CSL蛋白进行同源建模,利用MOE软件预测CSL和NT蛋白之间的结合,并采用GST pull-down实验研究CSL和NT蛋白的结合特点。结果与MOE软件预测出CSL和NT蛋白可以结合,且在NT蛋白上存在两个结合位点;Pull-down实验进一步证实二者可以直接结合,且该结合具有CSL浓度依赖性。结论 CSL可以与NT蛋白结合,为进一步揭示CaV1.2钙通道的调节机制奠定了基础。

低强度脉冲超声对大鼠牙本质损伤修复过程中钙离子转运相关蛋白表达的影响

目的:研究低强度脉冲超声(LIPUS)辐照SD大鼠牙本质损伤模型后对成牙本质细胞及牙髓细胞上钙离子转运相关蛋白的影响。方法:40只SD大鼠[(360±13)g]右侧上颌第一磨牙备洞建立牙本质损伤模型,随机对其中20只大鼠备洞牙及剩余20只大鼠左侧上颌第一磨牙予以超声辐照(强度30 mw/cm^2,频率1.5 MHz,频宽200μm,重复率1 kHz),形成备洞组、备洞+LIPUS组、LIPUS组及空白对照组(n=10),超声辐照每日1次,持续20 min,分别在辐照1、3、7、14 d后处死实验动物,应用HE染色观察牙本质-牙髓复合体组织结构及细胞形态变化,免疫组化染色及图像分析检测钙离子转运相关蛋白(Cav 1.2、NCX1)的表达差异。结果:组织形态学分析发现牙本质损伤后LIPUS可协同炎症反应促进第三期牙本质的形成,而LIPUS辐照正常牙未见明显病理改变出现。免疫组化分析发现备洞+LIPUS组在1 d及3 d时较备洞组各蛋白表达明显升高(P<0.05);LIPUS组1 d时Cav1.2表达较空白对照组高(P<0.05),其余时间点两者无差异。结论:LIPUS可能在牙本质损伤早期积极调控钙离子转运相关蛋白,加快第三期牙本质修复进程,其作用机制可能与炎症反应及机械效应相关。

妊娠期运动降低SHR子代血压的钙通道CACNA1C基因DNA甲基化机制

目的:观察妊娠期运动对自发性高血压大鼠(SHR)子代血压的影响,并探讨其血管平滑肌CaV1.2通道DNA甲基化机制。方法:WKY和SHR大鼠分别雌雄配种,孕鼠进行无负重游泳训练。分别检测3月龄(3M)和6月龄(6M)雄性子代体重、血压、肠系膜动脉反应性、血管平滑肌细胞CaV1.2通道全细胞电流、CaV1.2通道α1C亚基蛋白和mRNA水平及其CACNA1C基因DNA甲基化情况和DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表达。结果:妊娠期运动显著降低高血压子代血压(P<0.05)、肠系膜动脉对CaV1.2通道阻断剂Nifedipine(P<0.05)的血管张力敏感性和肠系膜动脉平滑肌细胞CaV1.2通道的全细胞电流(P<0.05)、CaV1.2通道α1C亚基蛋白表达(P<0.05)和mRNA水平(P<0.01)。同时,CACNA1C基因启动子区的DNA甲基化(P<0.05)以及DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表达均显著增加(P<0.01)。随年龄增加,妊娠期运动对6M高血压子代血压及CaV1.2通道功能的改善作用减弱。结论:妊娠期运动可显著降低高血压子代血压,CaV1.2通道α1C亚基基因CACNA1C启动子区的DNA甲基化可能是其重要机制之一;随年龄增长,这一改善作用逐渐减弱。