玻璃体腔注射roscovitine对大鼠视网膜中Cdk5/p25活性和tau蛋白磷酸化的抑制作用

背景 视网膜色素变性（RP）与阿尔茨海默病有着共同的发病机制,细胞周期依赖性蛋白激酶（Cdk5）活性及其激活剂参与中枢神经系统的退行性病变.Cdk5抑制剂roscovitine可以抑制Cdk5/p25通路的活性,从而抑制细胞凋亡,但其对RP的影响尚不清楚. 目的 探讨玻璃体腔注射roscovitine对RCS大鼠视网膜组织中p35、p25和tau蛋白表达的影响.方法 12只RCS大鼠于出生后17d右眼玻璃体腔注射4 μlroscovitine作为实验眼,左眼未进行任何干预作为对照眼.分别于注射后8d（出生后25 d）和18d（出生后35 d）用过量麻醉法各处死6只大鼠并分离视网膜,Western blot法检测RCS大鼠视网膜组织中Cdk5、p35、p25蛋白的相对表达水平和tau蛋白磷酸化水平,采用分光光度仪（光谱法）测定大鼠视网膜组织340 nm处的吸光度（A）值,定量分析大鼠视网膜中Cdk5/p25激酶活性,采用配对t检验比较实验眼和对照眼的检测结果.结果 玻璃体腔注射后8d和18d,大鼠实验眼视网膜组织中p35蛋白的相对表达水平分别为1.186±0.019和1.069±0.019,明显低于对照眼的1.364±0.016和1.214±0.008,差异均有统计学意义（t=-6.294、-6.477,均P＜0.05）;大鼠实验眼视网膜组织中p25蛋白的相对表达水平分别为0.312±0.009和0.269±0.018,明显低于对照眼的0.595±0.013和0.473±0.011,差异均有统计学意义（t=-36.508、-11.879,均P＜0.05）;实验眼与对照眼间大鼠视网膜中Cdk5蛋白的相对表达水平差异均无统计学意义（t=0.213、-0.540,均P＞0.05）;实验眼大鼠视网膜组织中tau蛋白磷酸化水平均低于对照眼,差异均有统计学意义（t=-9.854、-6.744,均P＜0.05）.玻璃体腔注射后8d和18d,比色定量测定法测得大鼠实验眼视网膜中Cdk5/p25活性分别为（0.003 8±0.000 14）mol/（s·mg）和（0.00201±0.000 11）mol/（s·mg）,明显低于对照眼的（0.005 47±0.000 27） mol/（s·mg）和（0.003 35±0.000 15） mol/（s·mg）,差异均有统计学意义（t=-9.152,P=0.000;t=-9.248,P=0.000）. 结论 玻璃体腔注射roscovitine可以在一定程度上抑制RCS大鼠视网膜组织中Cdk5/p25激酶活性及tau蛋白磷酸化水平.

基于Calpain/p35-Cdk5/p25通路探究肾脑复元汤联合hUC-MSCs干预对缺氧缺糖神经元的保护作用

目的:基于Calpain/p35-Cdk5/p25通路探究肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)干预对缺氧缺糖神经元的保护作用。方法:原代培养神经元,并随机分为正常组、模型组(缺糖缺氧造模,OGD)、中药组(OGD+含中药血清)、干细胞组(OGD+h UC-MSCs共培养)、联合组(OGD+含中药血清+h UC-MSCs共培养)、抑制剂组(OGD+Calpain抑制剂),采用CCK-8法检测神经元活力,AO/EB染色观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,Werstern blot法检测Cdk5、p25、p35的表达。结果:模型组神经元缺糖缺氧后,突起回缩,轴突网络稀释,细胞核变性、甚至碎裂,与正常组比较,细胞活力明显下降,大量细胞凋亡,Cdk5、p25表达明显上升,p35表达明显下降(P<0.01);与模型组比较,中药组、干细胞组、联合组及抑制剂组神经元活力升高,凋亡细胞数降低,Cdk5及p25表达下降,p35表达上升(P<0.05,P<0.01);与中药组、干细胞组及抑制剂组相比,联合组神经元活力升高、早凋细胞减少(P<0.05);联合组及抑制剂组CDK5、p25表达较中药组及干细胞组下降,p35表达较中药组及干细胞组上升(P<0.05)。结论:肾脑复元汤联合h UC-MSCs移植能显著改善缺糖缺氧神经元凋亡,其作用机制可能与调控Calpain/p35-Cdk5/p25通路有关。

X线照射原代培养大鼠海马神经元后p35、p25的表达及Cdk5激酶活性变化

目的研究X线照射培养大鼠海马神经元后p35,p25的表达及Cdk5激酶活性变化,为放射性脑损伤的预防和治疗提供理论依据。方法30GyX射线单次照射培养至12d的海马神经元,用Western-blotting检测Cdk5的激活蛋白p35、p25的水平,用DAPI染核方法检测海马神经元凋亡情况。结果p35蛋白水平在照射后3.5和4h分别比对照组升高(1.51±0.13)、(1.45±0.14)倍,差异均有统计学意义(P<0.01);p25蛋白水平在照射后6h比对照组升高(1.62±0.28)倍,差异有统计学意义(P<0.05)。30Gy组在照射后24h核固缩百分数为(24.8±3.97)%,与对照组(1.82%±1.08%)有显著性差异(P<0.01);30Gy+roscovitine组在照射后24h核固缩百分数为(7.74±2.27)%,与对照组有显著性差异(P<0.01)。结论X线照射培养海马神经元后p35、p25蛋白表达增加,激活cdk5;应用Cdk5抑制剂roscovitine抑制Cdk5活性可以显著减少神经元的凋亡。

CDK5、p35/p25在血管性认知损害患者血液中的表达

目的探讨细胞周期素依赖性蛋白激酶5(CDK5)、p35及p25在血管性认知损害(VCI)患者血液中的表达及可能作用。方法收集VCI病例91例,其中非痴呆性血管性认知损害(VCIND)49例,血管性痴呆(VAD)42例;同时收集脑卒中认知功能正常(NC)及健康人(N)各30例;应用RT-qPCR检测血液中CDK5mRNA的相对表达,Western blot法检测各组血液中CDK5、p35及p25的蛋白表达。结果各组CDK5mRNA相对表达及CDK5、p35、p25蛋白表达从高到低分别为VAD组>VCIND组>NC组>N组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 CDK5、p35及p25可能参与了VCI的发生,血管性认知功能损害程度与其表达水平呈正相关关系。

小檗碱通过抑制CDK5/P25表达逆转MMP+诱导帕金森病细胞模型损伤

目的探究小檗碱对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MMP+)诱导的帕金森病(PD)细胞模型损伤的保护机制。方法用不同浓度MMP+(10、25、50、100、200、400μmol·L^(-1))或小檗碱(2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μmol·L^(-1))处理小鼠中脑多巴胺能神经元(MN9D)48 h,最终选择MPP^(+)200μmol·L^(-1)诱导剂量和小檗碱10.0μmol·L^(-1)干预剂量进行后续实验。随机分为对照组(PD细胞不做任何处理)、MPP^(+)组(MPP^(+)200μmol·L^(-1)处理)和MPP^(+)+小檗碱组(小檗碱10μmol·L^(-1)预处理12 h,再以MPP^(+)200μmol·L^(-1)孵育48 h)。应用MTT实验和流式细胞术检测各组的细胞存活率和凋亡率;蛋白免疫印记法检测各组间calpain、caspase-3、CDK5、P35和P25蛋白的表达情况。结果MPP^(+)组呈剂量依赖性抑制MN9D细胞增殖。MPP^(+)+小檗碱组细胞存活率高于MPP^(+)组(t=6.837,P=0.002),细胞凋亡率低于MPP^(+)组(t=14.223,P<0.001)。MPP^(+)+小檗碱组calpain、caspase-3相对表达水平均低于MPP^(+)组(均P<0.001)。P35蛋白相对表达水平高于MPP^(+)组(P<0.001)。结论小檗碱逆转MPP^(+)刺激MN9D细胞的P35向P25转化,抑制calpain和caspase-3蛋白的表达,对MPP^(+)诱导的MN9D细胞损伤发挥保护作用。

甲醇对大鼠脑皮质中Calpain、CDK5/p35激酶及CDK5/p25激酶活力的影响

目的研究甲醇对成年SD大鼠脑皮质中Calpain、CDK5/p35激酶及CDK5/p25激酶活力的影响,为其神经毒性提供依据。方法选取体质量为(200±20) g的健康成年SD大鼠56只,雌雄各半,随机分为对照组、低、中、高剂量甲醇染毒组。染毒浓度分别用25.34、50.69、101.38 g/m3;对照组吸入清洁空气。每组共14只大鼠,分笼饲养。静式吸入染毒,每天2 h,连续28 d。采用酶联免疫吸附法检测大鼠脑皮质中Calpain、CDK5/p35激酶及CDK5/p25激酶活力浓度。结果低、中、高剂量甲醇染毒组大鼠脑皮质中CDK5/p35激酶活力浓度分别是(433.76±121.12)、(482.22±43.37)、(488.39±81.58) mU/L,明显高于对照组的(352.84±114.43) mU/L,差异均有统计学意义(P<0.05)。中、高剂量甲醇染毒组大鼠脑皮质中Calpain酶活力浓度分别为(3 596.70±344.10)、(3 714.68±458.70)U/L,明显高于对照组的(3 222.03±601.95)U/L和低剂量甲醇染毒组(3 223.59±221.79)U/L,差异有统计学意义(P<0.05)。而各组大鼠脑皮质中CDK5/p25激酶活力浓度比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 Calpain、CDK5/p35激酶可能参与甲醇致大鼠神经毒性作用。

雷公藤红素对APPswe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病模型小鼠肝叶部分切除术后认知功能及海马内Cdk5、p25和p35表达的影响

目的动态观察雷公藤红素对APPswe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病(alzheimers disease,AD)模型小鼠肝叶部分切除术后认知功能及海马内周期蛋白依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)和激动因子p25和p35表达的影响。方法 3月龄AD模型小鼠96只,随机均分为三组:手术组(S组),麻醉后行肝叶部分切除术;雷公藤红素组(C组),手术前3d上午腹腔注射雷公藤红素60μg/kg;二甲亚枫(DMSO)组(O组),手术前3d上午腹腔注射同体积的0.04%DMSO。三组随机抽取8只小鼠采用水迷宫连续训练5d并检测术后1、3、7、14d的学习记忆能力,余下小鼠分别于术后1、3、7、14d取标本,每次6只,检测海马内细胞Cdk5及激动因子p25、p35的表达。结果与C组比较,术后3、7和14dS和O组小鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.05)、目的象限时间百分比明显降低(P<0.05);与C组比较,S和O组术后3、7、14d海马内Cdk5表达和术后1、3、7、14d海马内p25表达明显增高(P<0.01)。三组小鼠海马内p35表达差异无统计学意义。结论雷公藤红素可改善肝叶部分切除术后AD模型小鼠的认知功能的下降,其机制可能与Cdk5和p25蛋白表达下降有关。

复智散通过细胞周期依赖性蛋白激酶5通路减轻皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化

目的探讨复方中药复智散(FZS)能否通过抑制细胞周期依赖性蛋白激酶5(CDK5)通路,减轻Aβ_(25-351)诱导的新生鼠皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化。方法选用24 h内新生Wistar大鼠,分离纯化皮层神经元,进行体外培养。皮层神经元在体外培养7 d后,应用20μmol·L-1Aβ_(25-351)作用于皮层神经元24 h。药物治疗组则应用FZS(20 mg·L^(-1))、CDK5抑制剂Roscovitine(15μmol·L^(-1))、钙蛋白酶(calpain)制剂Calpeptin(20μmol·L^(-1))预处理24 h,然后用20μmol·L^(-1)Aβ_(25-351)作用24 h。用Western blot检测Tau蛋白Ser396、Ser202和Thr231位点磷酸化水平和CDK5的激活蛋白p25/p35的蛋白水平;荧光酶标仪测定荧光强度来反映calpain活性;免疫沉淀法检测CDK5激酶活性。结果 20μmol·L^(-1)Aβ_(25-351)作用于皮层神经元24 h后,Tau蛋白在Ser396、Ser202、Thr231位点磷酸化水平增加,CDK5激酶活性升高,CDK5激活蛋白p25水平升高,calpain活性升高。20 mg·L-1FZS治疗组则明显抑制了Aβ_(25-351)导致的Tau蛋白在Ser396、Ser202、Thr231位点磷酸化水平增加,抑制了CDK5激酶活性、p25蛋白水平以及calpain活性升高。CDK5抑制剂roscovitine和calpain抑制剂calpeptin作为阳性对照药物也显示了抑制Tau蛋白过度磷酸化的作用。结论复智散可能通过calpain-p25/CDK5通路抑制Aβ_(25-351)导致的皮层神经元Tau蛋白过度磷酸化。

p25-CDK5-p53信号通路在甲醇致人神经母细胞瘤细胞凋亡中的作用

[背景]职业接触甲醇后可引起中枢神经系统损伤。有研究表明,在应激或毒性刺激下,钙激活蛋白酶(calpain)使p35蛋白转化为p25蛋白,激活钙依赖性蛋白激酶5(CDK5),p53蛋白积聚及磷酸化后出现神经细胞凋亡。甲醇是否可以激活calpain从而启动p25-CDK5-p53信号通路,通过经典线粒体途径使神经细胞凋亡,尚不明确。[目的]通过体外实验探究p25-CDK5-p53信号通路在甲醇致人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)凋亡中的作用。[方法]采用不同浓度甲醇(0、250、750、1250 mmol/L,即对照、低、中、高浓度组)分别染毒SK-N-SH细胞24 h后,采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR技术检测calpain2、CDK5、p35、p25、p53 mRNA表达水平;Western blotting检测calpain2、CDK5、p25、p35、p53及p53磷酸化蛋白表达水平。[结果]对照组及甲醇低、中、高浓度组处理24 h后细胞凋亡率分别为(8.15±1.77)%、(12.06±0.71)%、(13.81±0.67)%、(19.88±2.40)%,组间差异有统计学意义(F=29.05,P<0.01)。各浓度组calpain2、CDK5、p25、p53 mRNA相对表达水平差异均有统计学意义(F=10.02、61.48、28.91、21.12,P<0.01),各浓度组p35 mRNA相对表达水平差异无统计学意义(F=0.96,P>0.05)。与对照组相比,甲醇低、中浓度组calpain2、CDK5、p25 mRNA相对表达水平差异均无统计学意义(P>0.05),甲醇中浓度组p53 mRNA相对表达水平升高(P<0.01),高浓度组calpain2、CDK5、p25、p53 mRNA相对表达水平升高(P<0.01)。各浓度组calpain2、CDK5、p35、p25、p53磷酸化蛋白、p53蛋白相对表达水平差异具有统计学意义(F=32.29、17.60、35.02、35.92、93.72、11.00,P<0.05)。与对照组相比,低、中、高浓度组calpain2、CDK5、p35、p25、p53磷酸化蛋白相对表达水平升高(P<0.05),中、高浓度组p53蛋白相对表达水平升高(P<0.05),低浓度组p53蛋白相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]甲醇染毒后可使calpain2、p35、p25及CDK5蛋白表达水平增加,p53蛋白积聚及其磷酸化,和SK-N-SH神经细胞凋亡。

CDK5在鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元凋亡中的作用

目的探讨CDK5在鱼藤酮介导的SH-SY5Y细胞凋亡中的作用以及通过干预CDK5表达对细胞凋亡的影响。方法使用鱼藤酮处理多巴胺能神经元SH-SY5Y细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力,Annexin-V/PI染色,流式细胞仪检测不同实验组细胞凋亡率,采用Western blot法检测不同实验组CDK5的表达以及p25/p35蛋白的表达比。结果经鱼藤酮处理后细胞活力呈浓度依赖性下降,细胞凋亡率增高,且CDK5表达增高,p25/p35比值增高。CDK5抑制剂MDL28170或Olomoucine预处理细胞能够降低CDK5的表达水平,降低p25/p35蛋白的表达比,同时可以减轻鱼藤酮诱导的细胞损伤。结论 CDK5在鱼藤酮介导的SH-SY5Y细胞凋亡中可能发挥着重要作用,抑制CDK5的活性可能具有神经保护作用。

细胞周期蛋白依赖性激酶及膜锚定蛋白在甲醇诱导大鼠神经细胞凋亡中的作用

目的通过对不同性别SD大鼠甲醇吸入染毒,探讨钙离子依赖性的半胱氨酸蛋白酶(calpain)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK5)、膜锚定蛋白(p35、p25)在甲醇诱导大鼠神经细胞凋亡中的相关作用机制。方法将80只SFP级SD大鼠随机分为对照组及低、中、高剂量甲醇染毒组(剂量分别为25.34、50.69、101.38 g/m3),每组20只,雌雄各半。吸入染毒28 d后,测定雌雄大鼠的体重增长情况,采用TUNEL试剂盒检测大鼠脑皮质神经细胞凋亡情况,采用q-PCR法及蛋白免疫印迹法分别检测不同性别、不同剂量组大鼠皮质中calpain、p35、p25、CDK5的mRNA及蛋白表达水平。结果甲醇染毒组大鼠皮质神经细胞凋亡率与对照组相比明显升高,中、高剂量组大鼠神经细胞的凋亡率高于低剂量组,高剂量组高于中剂量组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且随着甲醇剂量的增加,脑组织细胞凋亡越明显。对于雌性大鼠,甲醇高剂量组脑皮质p35/p25 mRNA高于对照组、低剂量组,高剂量组脑皮质calpain mRNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);对于雄性大鼠,甲醇高剂量组脑皮质p35/p25、calpain、CDK5 mRNA表达量高于对照组、低和中剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。相同性别间,高剂量组大鼠脑皮质中calpain、p35、CDK5蛋白表达水平明显高于对照组、低和中剂量组,中剂量组CDK5、p25蛋白表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。低、中剂量组雄性大鼠p35蛋白表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论甲醇暴露可导致雌雄大鼠大脑皮质中calpain、p25、p35、CDK5 mRNA表达及蛋白表达水平异常,并诱导神经细胞凋亡。