楚雄腮扁叶蜂雌虫头部交配响应转录组表达分析

为明确楚雄腮扁叶蜂雌虫头部交配响应相关基因表达情况,取交配后1、6和24 h(交配后24 h开始产卵)以及未交配的雌虫头部进行转录组分析,通过基因功能注释和富集分析明确头部交配响应基因表达情况,并预测可能涉及的生物学过程。结果表明,与未交配组相比,交配组在交配后1、6和24 h分别有621(448个上调、173个下调)、918(389个上调、529个下调)和172个(124个上调、48个下调)差异表达基因(DEGs)。交配后1 h上调DEGs共富集到115条GO(基因本体)术语/KEGG(京都基因与基因组百科全书)通路,多涉及物质和能量代谢,如氨基酸和脂类的合成与分解等;交配后6和24 h上调DEGs共富集到35条GO术语/KEGG通路,涉及范围较广,包括环境信号、细胞凋亡、生长发育及消化系统等。交配后1、6和24 h下调DEGs共富集到89条GO术语/KEGG通路,所涉及的范围更广,如疾病、循环系统、寿命、免疫和环境信号等。此外还找到31个神经肽/神经肽受体编码基因[包括1个DH⁃PBAN(与滞育和性信息素合成有关)同源序列]、78个OBPs(气味结合蛋白)以及1个SPR(性肽受体),但其中除了2个OBPs相关基因在交配后6 h显著下调表达外,其余基因的表达并未受到交配的影响。采用荧光定量PCR方法对15个DEGs的表达进行验证,结果与RNAseq分析的结果相一致。由此可见,交配引起了楚雄腮扁叶蜂雌虫头部基因表达的快速响应。

基于转录组测序的楚雄腮扁叶蜂飞行肌蛋白及飞行能量代谢相关酶挖掘

本研究旨在阐明楚雄腮扁叶蜂Cephalcia chuxiongica Xiao飞行肌结构蛋白及飞行能量代谢相关酶基因信息。首先采用电镜技术对楚雄腮扁叶蜂飞行肌进行了观察,结果表明,肌原纤维(由粗丝和细丝组成,其数量比例为1∶3)是飞行肌的基本成分,肌原纤维横切面平均面积为0.771±0.042μm^(2),肌节平均长度为2.698±0.116μm。进一步通过飞行肌转录组分析,共筛选到11大类飞行肌结构蛋白,其中肌球蛋白(Myosin)和肌动蛋白(Actin)的转录本数较多,分别为127个和54个。发现1个飞行蛋白Flightin编码基因(可编码一个长152 aa的蛋白),在该蛋白中检测到6个模体结构(Motif),膜翅目昆虫中在Motif 1的一些位点上其氨基酸类型表现出明显的特异性。在楚雄腮扁叶蜂中筛选到了25个飞行能量代谢关键酶编码基因,并基于这些酶构建了三条飞行能量代谢途径,即糖酵解(涉及15种酶)、脂肪氧化(涉及6种酶)和脯氨酸氧化(涉及4种酶)。在楚雄腮扁叶蜂中发现4个3-磷酸甘油脱氢酶GPDH异构体,但并未在这些异构体中找到类似果蝇飞行肌GPDH异构体所具有的特异C端三联肽(QNL),表明GPDH的进化存在物种特异性。

基于Maxent模型的楚雄腮扁叶蜂潜在分布区预测

基于2011～2012年随机调查和收集楚雄腮扁叶蜂在中国西南地区的22个自然分布点数据,并结合分布点的环境变量,采用Maxent最大熵值模型,对楚雄腮扁叶蜂在中国的适生范围进行预测研究。结果表明,楚雄腮扁叶蜂主要分布于云南大部分地区和四川、贵州、广西的部分地区,潜在分布于广东雷州半岛及海南的西部、南部沿海地区。用Maxent模型预测楚雄腮扁叶蜂潜在分布的训练数据和测试数据的AUC值均为0.997,精度极高。用刀切法对各环境变量重要性的检测表明,温度因素对楚雄腮扁叶蜂的潜在分布影响最大。

楚雄腮扁叶蜂幼虫取食对寄主植物营养成分的影响

应用生物化学方法测定楚雄腮扁叶蜂Cephalcia chuxiongica Xiao幼虫取食后寄主植物华山松Pinus armandii和云南松Pinus yunnanensis松针营养成分的变化。结果表明:楚雄腮扁叶蜂幼虫取食后,华山松和云南松松针的水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、还原糖、总糖和磷(P)含量下降,而钙(Ca)含量上升,营养物质含量与健康松针比多存在显著差异。云南松在灰分、粗脂肪、粗蛋白和总糖含量的减少量大于华山松;而华山松在水分、粗纤维、还原糖和磷含量的减少量,钙含量的增加量大于云南松。楚雄腮扁叶蜂幼虫取食对寄主植物营养成分含量产生显著影响,华山松和云南松对幼虫取食具有应激反应机制,且对幼虫的抗性及防御能力存在明显差异。

楚雄腮扁叶蜂虫生真菌的分离鉴定及其致病性

从云南省寻甸县采集到自然罹病死亡的楚雄腮扁叶蜂Cephalcia chuxiongica幼虫虫尸上分离到致病性虫生真菌5株：SWYH01,SWYH02,SWYH06,SWYH07和SWYH09,经形态和分子生物学鉴定,分别为布氏白僵菌Beauveria brongniartii、淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus、淡色丛赤壳Bionectria ochroleuca、粉质棒束孢Isaria farinose、球孢白僵菌Beauveria bassiana。用各菌株的孢子悬浮液接种楚雄腮扁叶蜂幼虫,研究其致病性,结果表明,1.5×108个/m L的孢子悬浮液处理16 d后,楚雄腮扁叶蜂幼虫的校正死亡率43.64%~100%,说明这5株菌对楚雄腮扁叶蜂幼虫均有一定的致病性,其中淡色丛赤壳致病性最强。

楚雄腮扁叶蜂危害诱导松针挥发性物质的成分分析

采用水蒸气蒸馏和GC-MS方法对云南松健康植株和受楚雄腮扁叶蜂不同程度取食危害植株松针挥发性物质进行了分析和鉴定。从云南松健康植株、严重危害植株、中度危害植株以及轻度危害植株的松针中分别分离出17、15、19种和13种挥发性化合物,共确定33种挥发物成分。并利用色谱峰面积归一法,通过HPMSD化学工作站数据处理系统测得各化合物成分在挥发油中的百分含量。结果表明,云南松受楚雄腮扁叶蜂危害后,松针中产生和释放的挥发性化合物成分和含量均发生了较大变化,且植株受害程度不同,挥发性物质成分和含量存在显著差异。

基于楚雄腮扁叶蜂产卵行为的云南松针叶挥发性物质分析

室内测定了楚雄腮扁叶蜂雌蜂在云南松针叶不同部位的产卵量和雌蜂对松针不同部位挥发性物质的趋向反应,并运用GC-MS方法分析了健康松针和衰弱松针不同部位挥发性物质的组分及含量变化.结果表明,楚雄腮扁叶蜂雌蜂在健康松针上的产卵量多于衰弱松针,且在健康松针中部的产卵量最高;健康松针中部挥发性物质对雌蜂具有较强的引诱作用;健康松针和衰弱松针不同部位挥发性物质的种类及挥发量存在显著差异,主要表现为β-蒎烯、石竹烯、β-榄香烯、α-石竹烯、毕澄茄烯等相对含量发生显著变化,且健康松针和衰弱松针均产生了各自的特异性挥发物.

粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03侵染楚雄腮扁叶蜂幼虫的扫描电镜及透射电镜观察

【目的】了解粉红粘帚霉对楚雄腮扁叶蜂幼虫的侵染过程,为粉红粘帚霉对楚雄腮扁叶蜂的致病机理研究提供参考。【方法】利用扫描电镜和透射电镜技术对粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03孢子侵染楚雄腮扁叶蜂幼虫体表过程及其超微结构的变化进行观察研究。【结果】扫描电镜结果显示,接种6 h后,粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03分生孢子成功附着于幼虫体壁的气门、节间膜等部位;接种14 h后,粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03孢子萌发出芽管,并侵入体壁;接种26 h后,孢子和菌丝穿透楚雄腮扁叶蜂幼虫体壁,且菌丝迅速生长;接种72 h后,菌丝穿出虫体表面,并长出产孢结构。透射电镜观察发现粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03菌丝在穿透幼虫体壁过程中,会伴随酶的参与和组织溶解现象;接种6 h后,粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03分生孢子附着于幼虫体壁的两个节间褶间的部位;接种14 h后,分生孢子萌发并进入表皮细胞层分泌物中;接种26 h后,菌丝侵入表皮并扩展蔓延,且在菌丝周围出现电子密度很低的光晕;接种38 h后,皮细胞层细胞排列松弛变成空泡;接种48 h后,菌丝充满虫体,表皮层出现大量菌丝。【结论】粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03孢子及菌丝能寄生楚雄腮扁叶蜂幼虫,并可致其死亡。观察结果准确反映了粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03对楚雄腮扁叶蜂幼虫的侵染过程,并证实了侵染过程中酶与代谢产物的存在。

楚雄腮扁叶蜂聚集产卵引诱物质初探

为了探索严重危害云南松等松属植物的楚雄腮扁叶蜂(Cephalcia chuxiongica Xiao)雌蜂聚集产卵和幼虫聚集取食的化学机制,利用Y型嗅觉仪测试了楚雄腮扁叶蜂雌蜂对相关气味源的趋向反应。单向选择试验结果表明:未交尾雌蜂对松针和带卵松针粗提液的挥发物具有明显趋向反应,但对松针、带卵松针、未交尾雌蜂产卵器和已交尾雌蜂产卵器的淋洗液未做出趋向反应;已交尾雌蜂对松针淋洗液、未交尾雌蜂产卵器淋洗液没有表现出趋向反应,但可被松针粗提液、带卵松针粗提液和淋洗液、已交尾雌蜂产卵器淋洗液所引诱。双向选择试验表明,与松针淋洗液及未交尾雌蜂产卵器淋洗液相比,已交尾雌蜂更趋向于带卵松针淋洗液和已交尾雌蜂产卵器淋洗液。根据试验结果可以推测:1)松针挥发性物质在楚雄腮扁叶蜂已交尾雌蜂的寄主搜寻和选择中发挥作用;2)产卵雌蜂生殖副腺分泌物(包括新卵表面附着的分泌物)是引诱楚雄腮扁叶蜂雌蜂聚集在同一个松梢上产卵的活性物质。

楚雄腮扁叶蜂虫生真菌粉红粘帚霉的鉴定及其生物学特性

为明确楚雄腮扁叶蜂Cephalcia chuxiongica病原真菌的种类,以组织分离法对自然罹病死亡的楚雄腮扁叶蜂进行虫生真菌的分离培养,根据形态学特征和rDNA ITS序列分析对所得虫生真菌进行鉴定,并对其中的高毒力菌株进行生物学特性测定。结果表明:共分离得到4属25株菌株,其中以粉红粘帚霉Clonostachys rosea出现频率最高,共分离到15株,均与GenBank中粉红粘帚霉相关菌株亲缘关系最近,ITS序列同源性达100%,属优势种。按照柯赫法则证实4个属的虫生真菌对楚雄腮扁叶蜂均有致病力,其中粉红粘帚霉致病力最强,其高毒力菌株SWFUYHL 02-01对楚雄腮扁叶蜂幼虫致死中时为10 h;蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基最适宜该菌株生长和产孢,其次是马铃薯葡萄糖琼脂培养基;该菌的最适生长温度为25℃,光照对其菌丝生长无显著影响;在以不同种类糖为碳源的培养基上该菌株均能生长,以蔗糖为碳源的培养基上产孢量最高,显著高于以其它糖为碳源时;适宜其生长的氮源是酵母浸出粉,适宜产孢的氮源是硝酸铵和尿素,以硫酸铵和酵母浸出粉为氮源时不产孢;适宜菌丝生长和产孢的无机盐分别是MnSO_4和MgSO_4,添加CaCl_2的培养基上未见产孢;光照对粉红粘帚霉孢子萌发无显著影响。粉红粘帚霉菌株在采样点的出现频率与其生物学特性完全吻合。