结直肠癌筛查人群血浆游离DNA浓度及其对甲基化筛检技术的影响

目的明确结直肠癌筛查人群血浆中游离DNA(cfDNA)浓度的特点,试验cfDNA定量能否提高血浆甲基化标志物筛查结直肠癌的性能。方法一项基于人群研究从社区招募40~74岁个体。结肠镜检查前进行问卷调查和抽血,纯化血浆cfDNA进行浓度测定,然后用MethyLight检测两种甲基化标志物(SEPT9和C9ORF50)。构建加或不加cfDNA浓度因素的多因素风险预测模型,生成接收操作曲线,比较诊断性能。结果最终纳入479例,其中进展期肿瘤58例。血浆cfDNA浓度最高的前10位个体平均(139.96±183.10),cfDNA浓度是其余个体(7.82±4.42)的18倍。cfDNA浓度升高者特征多样,仅与腹痛、高脂血症统计学相关。加或不加血浆cfDNA浓度的风险模型预测进展期肿瘤无显著差异(AUC=0.579和0.591,P=0.466)。对样本设置cfDNA浓度阳性阈值后,甲基化检测对进展期肿瘤敏感性(19.0%,95%CI:8.9~29.1)和特异性(89.1%,95%CI:86.1~92.1)并未提高。结论社区人群中少数看似正常的个体,由于未知原因,其血浆中cfDNA浓度较高。血浆cfDNA定量可能无助于大肠癌筛查。

宫颈癌患者循环DNA的定量及意义

目的检测宫颈癌患者血浆游离DNA含量并探讨其与临床病理特征之间的关系。方法收集42例宫颈癌、20例CINIII患者和20例健康妇女的外周血。用微量基因组提取试剂盒提取血浆DNA,用双链DNA高敏试剂盒和荧光仪测定血浆DNA含量。结果I期宫颈癌患者的血浆DNA水平为(12.78±5.58)ng/ml,明显高于正常组[(7.60±3.87)ng/ml]和CINIII组[(8.10±3.06)ng/ml],P=0.001;II-III期患者的血浆DNA水平为(17.99±7.81)ng/ml,明显高于I期患者,P=0.02;CINIII患者的血浆DNA水平与正常对照者之间无明显差别(P>0.05)。以正常对照者血浆DNA水平的95%可信区间上限15.70 ng/ml为界值,其诊断的敏感性为38.10%,特异性为92.50%,阳性预测值为84.21%,阴性预测值为58.73%。结论宫颈癌患者的血浆DNA水平与疾病的发生、发展密切相关,血浆DNA水平可能有助于宫颈癌的鉴别诊断。

宫颈癌患者血浆游离DNA的含量变化研究

目的：检测宫颈癌患者血浆游离DNA含量并探讨其与临床病理特征之间的关系。方法：收集42例宫颈癌、20例宫颈鳞状上皮内瘤样病变Ⅲ患者和20例健康妇女的外周血,用微量基因组提取试剂盒提取血浆DNA,用双链DNA高敏试剂盒和荧光仪测定血浆DNA含量。结果：宫颈癌患者的血浆DNA水平（15.14±7.10）ng/mL明显高于宫颈鳞状上皮内瘤样病变Ⅲ（8.10±3.06）ng/mL和正常对照组（7.60±3.87）ng/mL（P〈0.05）,宫颈鳞状上皮内瘤样病变Ⅲ和正常对照组之间差异无统计学意义（P〉0.05）。Ⅰ期宫颈癌患者的血浆DNA水平（12.78±5.58）ng/mL明显高于正常和宫颈鳞状上皮内瘤样病变Ⅲ组（P〈0.05）,Ⅱ-Ⅲ期患者的血浆DNA水平（17.99±7.81）ng/mL明显高于Ⅰ期组（P〈0.05）。Ⅰ-ⅡA期患者中,肿块直径〉4 cm者的血浆DNA水平（15.60±6.13）ng/mL明显高于肿块直径〈4cm者（9.68±2.84）ng/mL（P〈0.05）。以正常对照者血浆DNA水平的95%可信区间上限15.70 ng/mL为界值,其诊断的敏感性为38.10%,特异性为92.50%,阳性预测值为84.21%,阴性预测值为58.73%。结论：宫颈癌患者的血浆DNA水平与疾病的发生、发展和预后密切相关,血浆DNA水平可能有助于宫颈癌的鉴别诊断。

血浆DNA甲基化检测在宫颈疾病诊断中的应用

目的对宫颈疾病患者血浆APC和RASSF1A基因启动子甲基化水平进行定量检测,探讨其在宫颈疾病诊断中的意义。方法收集34例宫颈低度病变(CINⅠ期)、43例宫颈高度病变(包含CINⅡ、CINⅢ期)、41例宫颈癌患者治疗前血浆及25例健康妇女血浆。另收集31例与血浆对应的宫颈组织标本。用双重实时荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)技术检测APC和RASSF1A基因启动子甲基化水平并进行统计学分析。结果宫颈疾病患者血浆中APC和RASSF1A甲基化水平与肿瘤组织有较好的一致性,且肿瘤组织水平高于血浆水平(Z分别为-2.236和-3.228,P均<0.05)。宫颈癌组血浆APC与RASSF1A甲基化率均高于低度病变组(P均<0.05);宫颈高度病变组血浆RASSF1A甲基化率也高于低度病变组,差异有显著性(P<0.05)。血浆APC和RASSF1A甲基化阳性结果在低度病变组、高度病变组和宫颈癌组均无显著性差异(P>0.05)。结论血浆DNA甲基化水平能反映宫颈癌的发生、发展变化,在宫颈癌的早期诊断中可能有重要价值。

血浆游离DNA定量检测在胃癌诊断中的价值

目的探讨血浆游离DNA定量检测在胃癌诊断中的价值。方法收集33例胃癌患者、44例健康对照者血液标本,血浆微量DNA抽提试剂盒提取血浆游离DNA,实时荧光定量PCR检测血浆游离DNA含量,评价血浆游离DNA水平在胃癌的诊断中的价值。结果胃癌组血浆游离DNA水平高于对照组(P<0.001);胃癌敏感性和特异度分别72.7%和93.2%,ROC曲线下面积为0.902。TNMⅢ期患者血浆游离DNA水平高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。结论血浆游离DNA定量检测对胃癌的诊断具有一定的临床意义。

血浆游离DNA甲基化靶向测序在结直肠癌中的应用价值

目的检测结直肠癌(CRC)患者血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)的甲基化水平,并分析其临床应用价值。方法收集38例大连大学附属新华医院就诊的CRC患者(Ⅰ~Ⅲ期)及38例体检健康者的血液标本,采用化学发光法检测血清癌胚抗原(CEA)水平;提取CRC组及体检健康者血浆cfDNA,行高通量甲基化靶向测序检测,计算甲基化评分,并分析其与CRC患者临床病理参数的关系;ROC曲线评估cfDNA和CEA单独及联合检测筛查CRC的临床价值。结果与健康人对照组相比,CRC组cfDNA浓度差异无统计学意义(34.41±5.00 vs 36.59±4.46,t=0.326,P=0.745),而cfDNA甲基化评分显著升高(0.53±0.27 vs 0.26±0.18,t=6.134,P<0.001)。伴有淋巴结转移的CRC患者cfDNA甲基化阳性率较无淋巴结转移者显著升高(88.9%vs 60%,χ^(2)=4.323,P=0.038),但在不同性别、年龄、肿瘤位置分组中的差异均无统计学意义(P均>0.05)。ROC曲线分析结果显示,cfDNA甲基化检测筛查CRC的ROC曲线下面积(AUC_(ROC))为0.892(95%CI:0.814~0.970),血清CEA为0.810(95%CI:0.707~0.909),二者联合检测的AUC_(ROC)为0.930(95%CI:0.8674~0.9967)。cfDNA甲基化检测的敏感性为84.21%,特异性为86.84%(cut-off值为0.2805);CEA单独检测的敏感性为42.1%,特异性为97.3%(cut-off值为4.0 ng/mL);二者联合检测的敏感性显著升高(89.47%),特异性为91.89%,准确性为90.67%。结论血浆cfDNA甲基化检测在CRC筛查中的敏感性和特异性较高,并且与淋巴结转移相关,具有较好的临床应用价值。

血清cf-DNA对宫颈癌早期辅助诊断的价值研究

目的探讨血清循环游离DNA(cf-DNA)对宫颈癌的早期辅助诊断的价值。方法选择2012年3月至2014年5月陕西省第二人民医院妇产科收治的36例宫颈癌患者为宫颈癌组,并选择同期收治的30例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅲ患者(CINⅢ组)、30例体检健康妇女(健康组)为对照研究,比较三组血清cf-DNA水平的差异,分析36例宫颈癌患者的cf-DNA水平与临床病理特征的相关性。与血清鳞状细胞癌抗原(SCCA)、糖类抗原(CA125、CA19-9)诊断价值进行比较。结果宫颈癌组患者的cf-DNA水平高于CINⅢ组及健康组[(16±3)μg/L比(8±3)μg/L、(8±4)μg/L],差异有统计学意义(P<0.01)。Ⅱ~Ⅲ期和肿瘤直径≥4 cm的宫颈癌患者cf-DNA水平高于Ⅰ期和肿瘤直径<4 cm的患者(P<0.05)。受试者工作特征曲线分析显示,cf-DNA、SCCA、CA125及CA19-9对宫颈癌诊断ROC曲线下面积分别为0.976,0.764,0.608,0.598,约登指数分别53.9%、26.1%、4.4%、3.3%,cf-DNA总体诊断效能显著优于其他指标。结论血清cf-DNA水平的检测有助于临床早期诊断宫颈癌及判断其治疗预后,值得临床推广。

血CTCs和cfDNA联合检测与传统肿瘤标志物检测在辅助诊断乳腺癌中的应用价值比较

目的比较血循环肿瘤细胞(CTCs)、循环游离DNA(cf DNA)联合检测与传统肿瘤标志物糖蛋白抗原153(CA153)检测在辅助诊断乳腺癌中的应用价值。方法回顾性选择2017年1月到2019年6月在安徽省第二人民医院收治的82例被确诊的乳腺癌患者为乳腺癌组,选取同期收治的50例乳腺良性疾病患者为乳腺良性疾病组,50例于该院体检的健康女性为对照组。采用ROCHE化学发光仪检测血清CA153水平;采用qPCR检测血浆cf DNA基因水平(241 bp hTERT和100 bp hTERT)和完整性(241 bp hTERT/100 bp hTERT);采用Ce1l Search系统检测血CTCs;受试者工作曲线(ROC)分析血CA153、cf DNA与CTCs诊断乳腺癌的诊断价值。结果乳腺癌组患者的血CTCs阳性表达率为37. 80%,明显高于乳腺良性疾病组的16. 00%(P <0. 05),明显高于对照组的12. 00%(P <0. 05);乳腺癌组的血CA153、241 bp hTERT、100 bp hTERT、241 bp hTERT/100 bp hTERT水平均明显高于乳腺良性疾病组(P <0. 05),乳腺良性疾病组的血CA153、241 bp hTERT、100 bp hTERT、241 bp hTERT/100 bp h TERT水平均明显高于对照组(P <0. 05);ROC分析显示,血cf DNA 241 bp hTERT、100 bp hTERT、241 bp hTERT/100 bp hTERT以及三者联合诊断乳腺癌的曲线下面积(AUC)依次为0. 865、0. 725、0. 870和0. 950;血CTCs和CA153诊断乳腺癌的AUC为0. 609和0. 733,明显低于cf DNA诊断的0. 950。结论血cf DNA对乳腺癌具有较高的诊断价值,有望应用于乳腺癌患者的临床辅助诊断。

非小细胞肺癌血浆EGFR突变与肿瘤标志物水平的关系

目的探讨非小细胞肺癌外周血游离DNA样本EGFR突变率与临床基线特征和血清肿瘤标志物表达水平的关系。方法收集本院确诊为非小细胞肺癌166例。利用PCR和变性高效液相色谱法分析EGFR19和21外显子突变。其中89例同时利用多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统检测癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原153(CA153)等血清肿瘤标志物,分析突变率与临床基线特征和肿瘤标志物表达水平的关系。结果 166例非小细胞肺癌中,EGFR总突变率19.9%。女性突变率显著高于男性(P=0.037)。腺癌突变率高于其他组织学类型,但未达到显著水平(P=0.096)。CEA、CA153中高表达患者EGFR突变率显著高于低表达者(P=0.048,P=0.017),CA199高表达患者仅有高于中低表达者的趋势(P=0.093)。多变量Logistic分析表明,组织学类型为腺癌,CA153、CEA中、高表达与EGFR突变率相关。结论对于晚期非小细胞肺癌,血浆EGFR突变率与血清肿瘤标志物表达水平明显相关。其标志物水平可作为进一步判断EGFR突变优势群体的因素。

实时荧光定量PCR检测宫颈癌患者血浆HPV的临床意义

目的分析实时荧光定量PCR检测血浆中人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16、18的可行性,并探讨其对宫颈癌诊断和预后评估的价值。方法收集2008年6月至2009年5月确诊的宫颈癌患者140例,癌前病变10例,以及正常对照者35例。采用改良通用引物PGMY和PCR-反向点杂交法对宫颈活检组织进行HPV基因扩增与分型。应用real-time PCR方法检测血浆HPV16、18 DNA水平,观察HPV DNA的感染率和病毒含量,分析其与宫颈癌临床分期的相关性。结果在宫颈组织HPV16、18阳性患者中,血浆HPV感染率分别为57.9%和23.8%。随着宫颈癌临床病期的发展,血浆HPV16 DNA检出率逐渐增加(P<0.001),但病毒含量的变化无统计学意义(P=0.277)。血浆HPV18病毒检出率和病毒拷贝数与宫颈癌临床分期均无相关(P=0.609,P=0.512)。结论血浆HPV DNA定量检测是一种可靠的实验方法,对宫颈癌的诊断和预后监测具有重要价值。

利用微滴数字PCR进行CpG岛甲基化表型结直肠癌分子分型

目的:利用微滴数字PCR(droplet digital PCR,DD-PCR)技术进行CpG岛甲基化表型(CpG island methylation phenotype,CIMP)结直肠癌分型,并探讨以血浆游离DNA进行CIMP分型的可行性。方法:收集2008到2012年在长海医院行结直肠癌手术的患者216例,抽提肿瘤组织DNA和血浆游离DNA,重亚硫酸盐处理后,利用DD-PCR进行CIMP分型。CIMP分型选用CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3、SOCS1五个基因的甲基化位点,利用免疫组织化学技术(IHC)检测P53突变情况,以巢式PCR测序方法检测K-RAS和BRAF突变。结果:216例肿瘤中17例(7.9%)存在BRAF突变,96例(44.4%)存在K-RAS突变和112例(51.9%)P53-IHC(+)。31.5%(68/216)的结直肠癌为CIMP(+)(5个基因位点中高甲基化位点数目≥3),82.3%(14/17)的BRAF突变属于CIMP(+),而只有9.4%(9/96)的K-RAS突变和7.1%(8/112)的P53突变属于CIMP(+)。除了K-RAS,BRAF和P53突变外,同CIMP(-)结直肠癌相比,CIMP(+)肿瘤还具有独特的临床病理特征:肿瘤更易发生在结直肠的近端位置,黏液性癌比例偏高,分化程度较高,CIMP(+)患者生存时间显著短于CIMP(-)患者。利用血浆游离DNA进行分型和利用肿瘤组织进行分型的一致性为93.4%、灵敏度为87.2%、特异性为100%。结论:CIMP(+)结直肠癌具有独特的临床病理特征,且预后较差;在缺乏肿瘤组织的情况下,利用DD-PCR对血浆游离DNA进行CIMP分型是可行的。

数字PCR在液体活检中的研究进展

数字PCR是近几年新兴的核酸检测手段,因其具有高灵敏度、高精确度、高重现性,正在逐渐取代先前的普通PCR方法。数字PCR目前已广泛应用在SNP、甲基化、二代测序辅助建库、疾病的诊断和治疗监控、微生物(病毒、细菌等)的检测,它将会有力推动生命科学、医学诊断、检验检疫、农业等领域的快速发展。本综述主要讨论数字PCR在检测血浆游离DNA方面的研究进展。

血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化在肺癌筛查中的意义

目的探讨血浆中SHOX2和PTGER4基因甲基化状态在肺癌无创筛查中的意义。方法选取联勤保障部队第九八八医院2018年1月~2019年4月受检者176例,抽取受检者静脉血10 ml,提取血浆游离DNA,,经重亚硫酸盐转化后荧光定量PCR扩增,分析SHOX2和PTGER4基因甲基化情况。并进行活检组织标本病理诊断。分析甲基化与病理结果和其他临床特征的关系。结果共检测176例,男性121例,女性55例。肺癌组93例,包含鳞癌34例,腺癌41例,小细胞癌17例,大细胞神经内分泌癌1例;对照组83例,包含肺炎或支气管炎67例,肺结核2例,间质性肺炎4例,健康体检者10例。血浆SHOX2和PTGER4基因检测肺癌的灵敏性和特异性是74%和85.1%。肺癌组基因甲基化阳性率为83.9%(78/93),显著高于对照组(28.9%,24/83),差异有统计学意义(P<0.05),且与病理类型和TNM分期有关。鳞状细胞癌、大细胞神经内分泌癌阳性率100%,小细胞癌82.4%(14/17),腺癌70.7%(29/41);TNM分期越高甲基化阳性率越高。对照组基因甲基化与肺纤维化或胸膜增厚无相关性。结论血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化检测可以成为肺癌患者筛查的一种方法,用于目前筛查方法的补充。

血浆游离DNA甲基化靶向测序在乳腺癌中的应用价值

目的检测乳腺癌(BRC)患者血浆游离DNA(Cf-DNA)的甲基化水平,并分析其临床应用价值。方法收集2021年12月-2022年6月就诊于佳木斯大学附属第一医院肿瘤外科50例患者血液标本,其中乳腺癌患者(Ⅰ~Ⅲ期)30例为实验组(tumor组),乳腺良性疾病患者20例为对照组(control组),采用化学发光法检测血清糖类抗原153(CA153)、血清糖类抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)水平,提取实验组及对照组患者Cf-DNA,行高通量甲基化靶向测序检测,评估甲基化水平;ROC曲线评估Cf-DNA和CA153、CA125、CEA单独及联合检测筛查乳腺癌的临床价值。结果实验组CA153、CA125、CEA水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组血浆Cf-DNA浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05);两组CCDC181启动子区甲基化水平、总体甲基化水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);ROC曲线显示,血清CEA诊断乳腺癌的曲线下面积(AUC)=0.766(95%CI:0.633~0.897),CA153的AUC=0.730(95%CI:0.591~0.869),CA125的AUC=0.788(95%CI:0.661~0.914),三者联合的AUC=0.923(95%CI:0.852~0.993),联合诊断的灵敏度、特异度、AUC均高于CA153、CA125和CEA单一诊断;CpG2120诊断乳腺癌的灵敏度及特异度最高,CpG1984、CpG2016及CpG2120联合诊断及单一诊断的灵敏度、特异度、AUC高于CA153、CA125和CEA单一或联合诊断。结论血浆Cf-DNA甲基化检测在乳腺癌筛查中的敏感性和特异性较高,具有较好的临床应用价值,联合肿瘤标志物可以提高乳腺癌的早期诊断率。

直接荧光定量法检测肺癌患者血浆游离DNA含量临床意义

目的探讨荧光染料直接染色法检测血浆游离DNA含量在肺癌诊断和预后判断中的意义。方法用picogreen荧光染料直接染色法测定不同浓度的人基因组DNA之吸光度,并依此制作标准曲线;收集27例肺癌患者(小细胞肺癌9例,非小细胞肺癌18例)和37例健康体检者新鲜血浆,用picogreen荧光染料直接染色法对血浆游离DNA进行染色,与标准曲线对比得出其含量。结果正常对照组血浆DNA水平(14.1±3.8)μg/L,肺癌组血浆DNA水平15.3μg/L^1771.2μg/L;18例非小细胞肺癌血浆DNA水平15.3μg/L^219.7μg/L,9例小细胞肺癌为68.5μg/L^1771.2μg/L。秩和检验显示:肺癌组明显高于正常对照组(P<0.05);小细胞肺癌组和非小细胞肺癌组之间也有显著性差异(P<0.05);小细胞肺癌伴转移组高于非转移组(P<0.05)。结论肺癌患者血浆游离DNA水平与疾病的发生、发展和预后密切相关,检测血浆DNA水平有助于肺癌的诊断和预后判断。

血浆游离DNA在非小细胞肺癌诊断中的价值

目的探讨血浆游离DNA水平在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的诊断价值。方法选取陕西省人民医院健康中心120例健康对照者,并提取收治呼吸内科的116例非小细胞肺癌患者的,采用荧光定量PCR方法检测血浆游离DNA水平。结果非小细胞肺癌组患者的血浆游离DNA水平为200.70±88.54 ng/ml,健康对照组的血浆游离DNA水平为18.65±6.30 ng/ml,组间比较差异有统计学意义(P<0.01);Ⅰ/Ⅱ期非小细胞肺癌患者的血浆游离DNA水平为172.75±72.87 ng/ml,Ⅲ/Ⅳ期非小细胞肺癌血浆游离DNA水平为221.88±93.86 ng/ml,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。血浆游离DNA水平与患者的年龄、性别、吸烟状况及组织学类型无明显相关性(P>0.05)。结论血浆游离DNA是一种新发现的肿瘤标志物,可作为非小细胞肺癌早期诊断和临床分期的有效工具。

血浆游离DNA在临床应用中的新进展

血浆游离DNA(Plasma cell-free DNA,cf-DNA)是存在于人体血液中一种无细胞状态的胞外DNA。作为细胞死亡的标记物,近年来cf-DNA检测已用于多种急性或慢性疾病的诊断和预后评价中。虽然在健康人群的血浆中也可测量到一定量的cf-DNA,但据相关报道称在癌症,自身免疫性疾病,中风,败血症,先兆子痫和器官移植排斥中cf-DNA呈显著的高水平。本文对cf-DNA在临床工作中应用的新进展做出综述,观察其在肿瘤诊断,产前诊断,脓毒症及老年免疫衰老评估作用中的新进展,发现其相较其他生物标记物敏感性并无太大差别,但特异性更高,还可能与肿瘤的转移机制相关。对于老年个体衰老的机制尚未明确,炎症学说也尚未得到证实,如何评定衰老以及明确衰老的标记物已成为全世界研究的难点,而cf-DNA浓度可能代表了一种全身炎症反应和老年人死亡率新的生物标志物。这些研究都使得cf-DNA应用于临床工作中的前途更加光明。

宫颈癌患者血清RASSF2A启动子甲基化检测意义

目的宫颈癌前病变进展为宫颈癌不仅在于高危型HPV持续感染,而且取决于抑癌基因CpG岛的高度甲基化。RAS相关结构域蛋白2A基因(RAS associated domain family 2Agene,RASSF2A)启动子甲基化可引起基因失活和转录抑制,导致肿瘤发生。本研究探讨了宫颈癌患者血清中RASSF2A启动子甲基化水平检测的意义及其对宫颈癌的诊断价值。方法收集2015-05-01-2016-09-30三峡大学人民医院妇科收治的宫颈癌患者57例和同期40名健康妇女(对照组)的血清,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)方法检测各组患者血清RASSF2A甲基化水平,并分析其与临床病理特征的关系。结果宫颈癌患者血清RASSF2A基因甲基启动子甲基化阳性率为36.84%(21/57),明显高于正常对照组,差异有统计学意义,χ~2=18.809,P<0.001。宫颈癌患者血清RASSF2A基因启动子甲基化率与患者临床分期(P=0.011)、淋巴结转移(P=0.006)之间差异有统计学意义,与年龄(P=0.520)、病理类型(P=0.175)差异无统计学意义。结论血清RASSF2A基因启动子的甲基化为宫颈癌的早期事件,参与了宫颈癌的发生发展。