嗜热毛壳菌外切葡聚糖纤维二糖水解酶的纯化和部分性质研究

研究液体发酵嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)产生的一种外切葡聚糖纤维二糖水解酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Sephacryl S-100分子筛层析、Q Sepharose Fast Flow强阴离子层析等步骤后获得凝胶电泳均一的外切葡聚糖纤维二糖水解酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法测得该酶的分子量大小约为66.3kDa和67.1kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为65℃和5.0。在60℃以下酶比较稳定,在70℃酶的半衰期为1h,在80℃下保温20min仍具有20%的活性,该酶的热稳定性较中温真菌的同类酶高,与国外报道的嗜热真菌的同类酶热稳定性接近。以pNPC为底物的Km值为0.956mmol/L。

嗜热毛壳菌纤维复合酶对饲料中蛋白质和能量代谢率的影响

本研究选用42日龄的健康AA肉鸡36羽,随机分成12组,采用排空强饲法研究了嗜热毛壳菌纤维复合酶对6种肉鸡常用饲料中粗蛋白质和能量代谢率的影响。试验选择肉鸡常用的3种蛋白质饲料(棉粕、豆粕和花生粕)和3种能量饲料(玉米、小麦和次粉),每种饲料分成2组,即对照组和加酶组。试验结果表明:嗜热毛壳菌纤维复合酶能显著提高棉粕和小麦中粗蛋白质的表观代谢率(P<0.05),对豆粕、花生粕、玉米和次粉中粗蛋白质的表观代谢率的影响差异不显著(P>0.05);能使小麦的表观代谢能提高7.52%(P<0.05),玉米和次粉的表观代谢能分别提高9.06%和10.93%(P<0.01)。使棉粕的表观代谢能提高5.12%,花生粕提高4.06%,豆粕提高1.91%(P>0.05);可以使玉米和次粉中能量的表观代谢率分别提高9.04%和10.95%,均差异极显著(P<0.01);小麦中能量的表观代谢率提高了7.55%(P<0.05)。对棉粕、花生粕、豆粕等蛋白质饲料中的能量表观代谢率无显著影响(P>0.05)。

嗜热毛壳菌多糖单加氧酶的性质及协同作用研究

多糖单加氧酶(polysaccharide monooxygenases, PMOs)可以氧化裂解纤维素,为纤维素酶提供更多的结合位点,对提高纤维素酶的活性具有重要意义。本研究旨在探索嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)AA9家族PMO5456的氧化方式,以及与不同类型纤维素酶的协同作用。通过对PMO反应产物进行鉴定,确定PMO5456具有C1、C4、C6位氧化。设置时间梯度,以PMO5456预处理的磷酸膨胀纤维素(PASC)为底物,测定PMO5456与嗜热毛壳菌三种纤维素酶EG1、CT2、CBH1的协同作用,结果显示随着PMO5456预处理纤维素时间的增加,纤维素酶的活性随之增加。PMO5456对三种纤维素酶EG1、CBH1、CT2的降解效率分别提高了3.6、2.2倍和60%。

嗜热毛壳菌基因组密码子偏好性研究

嗜热毛壳菌具有强大的木质纤维素降解能力,将其开发为优异的重组蛋白表达宿主有着广阔的应用前景。蛋白表达宿主的密码子偏好性对重组蛋白的表达水平具有重大影响。为确定嗜热毛壳菌中密码子的使用模式及影响因素,本研究以6897条CDS序列为对象,对其进行密码子偏好性分析。结果显示,嗜热毛壳菌中GC3的平均含量为66.2%,高于GC1(59.1%)和GC2(45.6%)的平均含量。Effective number of codon(ENC)分析与中性绘图分析结果显示,自然选择是影响嗜热毛壳菌密码子偏好性的主要因素。相关性分析结果显示,芳香族氨基酸比例与GC1含量及蛋白疏水水平呈极显著相关,说明密码子第一位的碱基组成对氨基酸是否具有芳香性影响较大。此外,在嗜热毛壳菌使用频率较高的密码子中,有24个以G/C末端结尾的密码子,进一步确定了23个高表达优越密码子和1个高表达最优密码子(CGC)。通过与其他模式真菌的密码子偏好性进行比较发现:与嗜热毛壳菌在密码子使用频率上差异较小的为嗜热毁丝菌、粗糙脉孢霉,有显著差异的为酿酒酵母。本研究为在嗜热毛壳菌中异源表达重组蛋白提供了目标基因密码子优化的理论依据,为嗜热毛壳菌在基因组水平上的应用和研究提供了数据支撑,有助于开发高效嗜热丝状真菌表达系统应用于工业酶制剂的生产。

嗜热真菌纤维素酶的CBD与海栖热袍菌的纤维素酶融合表达

将嗜热真菌毛壳菌纤维素酶Cel7A的纤维素结合结构域编码区与极端嗜热厌氧菌海栖热袍菌的纤维素酶CelB基因进行融合,构建重组质粒pHsh-CBD-CelB,并在大肠杆菌中表达。对融合蛋白进行纯化,通过热处理和离子交换层析,纯化到的融合蛋白SDS-PAGE电泳图谱显示为单一条带。对融合蛋白的特性研究,结果表明融合蛋白降解CMC的最适反应温度为90°C,结晶纤维素吸附实验表明该融合蛋白具有结合结晶纤维素的能力,并且融合蛋白降解CMC与结晶纤维素的能力得到提高。

嗜热毛壳菌锰超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质

目的克隆嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)锰超氧化物歧化酶(CtMnSOD)基因,进行毕赤酵母真核表达、纯化重组CtMnSOD蛋白,并分析其酶学性质。方法提取嗜热毛壳菌总RNA,根据CtMnSOD基因全长编码序列(登录号为EF569987)的开放阅读框设计合成引物,并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增产物经双酶切后连接入pPIC9K载体,重组质粒pPIC9K/CtMnSOD经SacⅠ线性化后,采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,并加入甲醇诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;重组CtMnSOD经硫酸铵沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化;并通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法测定酶学性质。结果 RT-PCR扩增产物约为684 bp。菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pPIC9K/CtMnSOD构建成功。SDS-PAGE结果显示,经甲醇诱导获得约22.7 k Da的可溶性重组蛋白。酶活力分析结果表明,工程菌酶活力达906.23 U/ml;该重组酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6.0;在70℃的条件下保温30 min后仍具有71%的酶活力。结论 CtMnSOD在毕赤酵母中高效分泌表达,该酶具有较高的热稳定性,具有较好的工业应用价值。