斑点叉尾病毒(CCV)结构蛋白的鉴定

采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化斑点叉尾病毒(Channel catfish virus,CCV),利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)对得到的样品进行分析。结果共鉴定了13种结构蛋白,包含1种未报道过的结构蛋白ORF22。实验结果为进一步研究CCV结构蛋白的功能及蛋白质组学提供了参考。

TaqMan实时荧光PCR快速检测斑点叉尾鮰病毒

根据GenBank登录的斑点叉尾鮰病毒株ORF8基因序列,设计引物和Taqman荧光探针,建立了用于检测斑点叉尾鮰（Ictalurus Punctatus）病毒的实时荧光定量PCR方法;对实时荧光定量PCR反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度和重复性,并建立了绝对定量方法。特异性试验证实,该方法只能检测到斑点叉尾鮰病毒,与真鲷虹彩病毒、蛙虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒等多种常见的水生动物病毒没有交叉反应,具有高度的特异性。标准曲线表明,在3.3×10~3.3×107拷贝数之间有较好的线性关系（r=0.998 3）,最少可检测到33个拷贝的阳性质粒,敏感度很高。同一样品于试验内及试验间的重复性试验发现,变异系数分别为0.7%和1.2%,重复性较好。该方法的检测时间从核酸抽提到出具结果仅需3h。试验结果表明,采用实时荧光PCR检测斑点叉尾鮰病毒方法具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短的特点,并且能对病毒进行准确的定量分析,不仅适合口岸进出口检验检疫的需求,而且可以作为研究该病毒感染过程的有力工具。

斑点叉尾病毒病研究概述

简要介绍了斑点叉尾病毒病的临床症状、流行病学特征、诊断与防治方法以及病毒的生物学特性与检测技术等。

斑点叉尾鮰疱疹病毒PCR-ELISA检测方法的建立

针对斑点叉尾鮰疱疹病毒(CCV)的ORF6基因设计引物和探针,PCR产物在扩增过程中标记地高辛,探针5′端用生物素标记,建立了CCV的敏感、快速、环保的PCR-ELISA检测方法。对反应条件进行了优化,并评估了该方法的特异性和敏感性。结果表明:该方法可特异性检测CCV DNA,与各对照均无交叉反应,具有高度特异性;该方法对CCV DNA的检测阈值为5 fg,敏感性是常规PCR检测方法的10倍。用此方法对人工感染样品进行检测,能够检测到感染组织中的CCV DNA。该方法能够定性和半定量检测CCV DNA,可用于斑点叉尾鮰疱疹病毒的检测、斑点叉尾鮰暴发性流行病的诊断。

斑点叉尾鮰病毒对几种淡水鱼类细胞系感染性的初步研究

研究斑点叉尾鮰病毒(Channel Catfish Virus,CCV)是否感染斑点叉尾鮰以外的鱼类,以评价CCV对我国珍稀、重要经济鱼类的潜在危害性。选择大眼鲑、草鱼、鲤、白鲟的细胞系为材料,从细胞病变、病毒增殖滴度等方面验证CCV对这些细胞系的感染性。实验表明,CCV对上述细胞系均可以感染,但细胞病变出现时间、病变程度和增殖滴度各有差异。其中,草鱼鳍条细胞系(GCF)、鲤上皮瘤细胞系(EPC)对CCV高度敏感。CCV在EPC中的增殖滴度与在斑点叉尾鮰卵巢细胞系(CCO)中相当,在GCF中的增殖滴度甚至高于CCO。研究结果表明,CCV除了感染CCO以外,还可以感染其它多种鱼类的细胞系,说明CCV病毒可能对斑点叉尾鮰以外的淡水鱼类具有感染性和潜在的危害性。

斑点叉尾鮰病毒ORF6基因的高效可溶表达及抗原性分析

利用GST融合基因表达系统表达GST-GP6融合蛋白,以质粒pMD19-T-ORF6为模板,扩增出ORF6基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2,将所构建的重组质粒pGEX-4T-2-ORF6转化E.coli ER2566,并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行10%SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果表明,大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-GP6融合蛋白相符,表达产物以可溶的形式存在。Western blot分析表明,融合蛋白能够与斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。

影响斑点叉尾病毒病发病因素的探索

斑点叉尾病毒(Channel catfish virus,CCV)通过滚环方式复制,可发生在10～35℃温度范围内,35℃时复制速度最快,而30℃时复制量最大,最适的复制温度是25～33℃。病毒的复制是几何倍数的增加,因此,病毒的初始浓度会对病毒的暴发造成影响,而种质也是影响病毒暴发的关键因素。该文就温度,病毒初始浓度以及种质三方面对斑点叉尾病的影响进行了初步探讨。

斑点叉尾病毒囊膜蛋白ORF6在昆虫细胞中的表达

为构建基于杆状病毒表达系统的CCV新型亚单位疫苗,将CCV的囊膜蛋白基因ORF6克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM 1质粒中,并将阳性重组转座质粒转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-ORF6。在脂质体介导下将该重组子转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒AC-ORF6。AC-ORF6感染的sf9昆虫细胞,经超薄切片电镜观察,可见重组杆状病毒呈多粒包埋,经间接免疫荧光、Western-blotting检测,CCV的ORF6蛋白可以在感染了AC-ORF6的sf9细胞中表达。研究表明,获得了插入ORF6基因的重组杆状病毒,并且该基因可以在重组杆状病毒介导下在昆虫细胞中表达,从而为基于CCV ORF6的杆状病毒亚单位疫苗研究奠定了基础。

斑点叉尾鮰病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus, CCV)属于大DNA病毒,是一种能引起斑点叉尾鮰(Letalurus punetaus)病毒性疾病的重要病原。研究以编码产物为磷酸激酶的CCV ORF77基因为靶标,设计了能识别靶基因上的8个独立区域的6条特异引物,利用基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了用于CCV的实时荧光LAMP快速检测方法。结果显示,建立的实时荧光LAMP检测方法在63℃恒温反应45min条件下,反应大约12min后出现明显的峰值,最低检测限度为100个拷贝的病毒质粒DNA,检出时间为35min;并且具有良好的特异性,与白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)等常见水生动物病原DNA均没有交叉反应;同一样品于试验内及试验间重复性试验发现,20个平行样品的扩增曲线基本重合,表现出良好的重复性。通过对实际样品的检测结果显示,实时荧光LAMP检测方法能够特异性的检出CCV。因此,研究建立的CCV实时荧光LAMP检测方法操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高、结果可靠,能为斑点叉尾鮰养殖现场和实验室的斑点叉尾鮰疱疹病毒病病原的快速诊断和实时监测方面提供技术支撑。

斑点叉尾鮰病毒多克隆抗体的制备及其生物活性鉴定

利用斑点叉尾鮰卵巢细胞增殖斑点叉尾鮰病毒,然后将经过超速离心纯化的病毒免疫4周龄BABL/C雌鼠。每2周免疫1次,第4次免疫2周后,经眼眶采血,分离血清,通过酶联免疫吸附试验检测其抗体效价,并利用间接免疫荧光试验和与病毒孵育试验检测所制备多克隆抗体的生物活性。结果表明,制备的多克隆抗体ELISA效价为1∶25 600,间接免疫荧光试验证明该多克隆抗体特异性良好,同时与病毒的孵育试验证明该多克隆抗体具备中和活性,能够有效阻断斑点叉尾鮰病毒对细胞的感染。

斑点叉尾鮰病毒宿主研究

为了解斑点叉尾鮰病毒(CCV)感染宿主范围和CCV病暴发的水温条件。本研究将斑点叉尾鮰、鳙鱼、加州鲈、鲫鱼、南方大口鲇、鲤鱼、胭脂鱼、岩原鲤、四川白甲、草鱼鱼苗各250尾,体质量约为25g,随机分成102组,每组20尾,分别通过浸泡感染、胸腔感染和胸腔感染暴发温度实验,实验期14d。结果表明,加州鲈和南方大口鲇对CCV非常易感,25℃斑点叉尾鮰和南方大口鲇死亡50%,加州鲈40%死亡;28℃斑点叉尾鮰和南方大口鲇全部死亡,加州鲈75%死亡;鲤鱼也会感染但不死亡,实验的其它鱼类没有组织病理学改变和临床症状出现。研究结果表明CCV对加州鲈和南方大口鲇敏感,暴发温度为25℃。

南方鲇稚鱼爆发性死亡的病原鉴定

2012年7月,四川简阳市某养殖户水泥培育池的南方鲇(Silurus meridionalis)稚鱼发生了爆发性死亡,针对患病南方鲇稚鱼进行了寄生虫学、细菌学及病毒学鉴定。结果显示,病鱼鳃丝压片及体表粘液涂片在光学显微镜下未发现寄生虫。无菌操作分离得到2株优势菌,对其进行了形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列分析及系统进化树构建,结果表明,这两株细菌均为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。动物回归感染试验表明其患病症状同自然发病症状,证明该菌为致病菌。14种常用药物敏感性试验结果显示,病菌对庆大霉素、多粘菌素B和美福仙敏感,对强力霉素、四环素、氟哌酸等10种药物不敏感。对病鱼组织匀浆攻毒试验和疑似病毒PCR检测,结果Ⅱ型疱疹病毒和蛙虹彩病毒特异性引物未能扩增出条带,仅斑点叉尾病毒orf 8引物扩增出157 bp大小的片段,且攻毒试验组鱼全部死亡,对照组鱼未死。因此确定该批爆发性死亡的南方鲇稚鱼感染斑点叉尾病毒。综上所述,此次爆发性死亡的南方鲇稚鱼病原经鉴定为斑点叉尾病毒和维氏气单胞菌。

斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法的建立

旨在建立一种基于PCR的焦磷酸测序检测方法,用于斑点叉尾鮰病毒病的快速检测和确诊。针对斑点叉尾鮰病毒（CCV）蛋白激酶（PK）基因的保守区域设计扩增引物与测序引物,经PCR扩增后对PCR产物进行焦磷酸测序,借助测序结果比对确定是否为CCV核酸序列。通过对反应条件与体系的优化,成功建立了CCV PK基因焦磷酸测序检测方法。结果表明：建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法扩增基因片段长度为144 bp,能够特异性检测出目的病毒,最低核酸检测限为5×10-6ng/μL,重复测序3次均能准确测出45 bp核酸序列。本研究建立的斑点叉尾鮰病毒焦磷酸测序检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适合高通量检测且耗时短仅需4 h,为CCV的快速检测提供了一种可行方法。

斑点叉尾鮰病毒病的传入风险评估报告

本文为评估斑点叉尾鮰病毒病(CCVD)跨境传播风险提出科学可行的防控措施,基于病原学和流行病学特征,对CCVD进入我国的可能因素进行了风险分析。分析认为,CCVD的传人威胁主要来自疫区的活养殖斑点叉尾鮰等活敏感鱼类,还有用于食用的活敏感鱼类,以及冰冻、冰鲜的敏感鱼类。因此,根据进口对象制定不同的风险管理方案并采取相应的检疫措施,对有效控制CCVD传入我国具有重要意义。