重组鸡白细胞介素18(rChIL-18)对MDV感染SPF鸡细胞免疫的影响

用马立克氏病病毒(MDV)感染5日龄SPF鸡后,取21日龄和35日龄鸡的淋巴细胞,运用3H-TdR掺入法检测T淋巴细胞对ConA和重组鸡白细胞介素18(rChIL-18)的反应,并用MTT法检测NK细胞和CTL对MD肿瘤细胞系CU147的杀伤活性及rChIL-18和IFN-γ对它们的作用。结果显示,SPF鸡感染MDV后淋转水平显著下降,NK细胞、CTL杀伤活性在感染后21日龄时升高,而在35日龄时NK细胞杀伤活性显著下降。rChIL-18对对照组和感染组SPF鸡的淋转水平和杀伤活性均有提高作用,同样IFN-γ也具有提高NK细胞和CTL杀伤活性的作用。

鸡白细胞介素18成熟蛋白全长基因的克隆与序列测定

根据已发表的鸡白细胞介素 18(IL- 18)成熟蛋白的 c DNA序列 ,设计 1对特异性引物 ,应用 RT- PCR从脂多糖(L PS)刺激 10 h活化的 MDCC- MSB1细胞中克隆到编码鸡 IL - 18成熟活性蛋白的完整基因片段 ,其大小为 5 10 bp。经序列测定证实 ,所获得的 c DNA基因序列与文献报道的结果完全一致 ,从而为进一步研究鸡 IL- 18的基因表达、生物学活性以及应用奠定了基础。

白细胞介素18和鸡白细胞介素18

白细胞介素 18是一种新发现的细胞因子 ,主要由单核巨噬细胞系统的细胞分泌。目前在分子水平上已经证明 ,人、哺乳动物和某些鸟类中都有 IL- 18存在。IL- 18在结构上属于 IL- 1家族 ,在功能上它与 IL- 12相似 ,且二者有协同效应。 IL- 18具有多种生物学功能 ,它不仅可以增强 Th1型免疫反应 ,而且在 Th2型免疫反应中也发挥一定的作用。人类医学研究证明 IL- 18在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力。在集约化畜禽养殖业中 ,包括白细胞介素 18在内的细胞因子作为天然的免疫调节剂 ,目前已被公认为是一种可以替代传统疗法的新型治疗剂。鸡 IL- 18基因是最近才被发现的 ,由于它具有与人和哺乳动物相似的生物学功能 ,因而鸡 IL- 18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。

鸡IL-18cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用RT PCR方法,从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系 MDCC MSB1 总 RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin 18,ChIL 18)成熟蛋白基因的 cDNA,并将其克隆到 pMD18 T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到的ChIL 18 cDNA与国外报道的完全一致,包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp,编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL 18 成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体 pGEX 6P 1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建成原核表达质粒 pGEX ChIL18。该质粒的 BL21(DE3)LysS转化菌在 IPTG的诱导下可高效表达GST ChIL18基因融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的32%。

海兰鸡白细胞介素-18全基因的克隆与序列分析

白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)是一种能诱导产生IFN-γ的新型细胞因子,在调节Thl型细胞免疫应答中起重要作用。根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列,自行设计一对引物,经植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾淋巴细胞后,提取其总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行了T-A克隆、测序,获得了中国海兰鸡IL-18基因全序列,其大小为597 bp,与在GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现,中国海兰鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。

表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-18基因重组禽痘病毒的构建

【目的】获得共表达H5亚型AIVHA基因和鸡IL-18基因的重组禽痘病毒。【方法】将含痘病毒启动子LP2EP2的HA基因和鸡IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSYHA/IL-18。用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达HA和IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-HA-IL-18)。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组禽痘病毒又进行了多次蚀斑克隆。【结果】以重组禽痘病毒DNA为模板,利用HA基因和鸡IL-18基因引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7kb带和1条0.6kb左右的带。以间接免疫荧光试验、T细胞转化试验和SPF雏鸡免疫接种证实重组禽痘病毒能表达HA和鸡IL-18,并初步证明鸡IL-18增强HA免疫作用。【结论】重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的HA和鸡IL-18。

鸡IL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫增强作用研究

为进一步评价鸡IL-18的免疫增强作用,用鸡白细胞介素18(IL-18)的真核表达质粒(pCI-IL-18)与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫SPF鸡,14日龄时首免,2周后二免,二免后5周用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.研究发现,鸡IL-18能显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的中和抗体水平及其对强毒攻击的保护力.结果提示,鸡IL-18(200μg)对IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有显著的免疫增强作用(P<0.05).

鸡白介素18基因原核表达质粒构建

根据已发表的江西土鸡白介素 -1 8(Ch IL-1 8) c DNA编码基因序列设计引物 ,用PCR技术从 p MDCh IL-1 8质粒扩增出编码鸡IL-1 8成熟蛋白基因 ,重组于 p BV2 2 0表达载体上 ,将重组质粒转化大肠杆菌 JM1 0 9(DE3 ) ,转化子经温度诱导的表达产物 ,SDS-PAGE电泳鉴定约 2万 ,N端开头 1 5个氨基酸序列测定分析 ,证明获得了鸡 IL-1 8成熟蛋白 ,为今后深入研究鸡 IL -1

鸡α干扰素/白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究

【目的】构建原核表达载体p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测,研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂,以对鸡的病毒性疾病进行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法,利用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)与鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)基因构建Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入p ET-28a原核表达载体中进行原核表达.通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDSPAGE分析、Western-blot鉴定.采用细胞病变抑制法检测r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【结果和结论】成功构建并克隆了p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因.融合基因在大肠埃希菌中表达的r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白相对分子质量约为38 000,蛋白经纯化后纯度在90%以上.r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和NDV的活性明显高于单一r Ch IFN-α、r Ch IL-18蛋白的抗病毒活性.

固始鸡白细胞介素18全基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列,自行设计1对引物,应用RT-PCR技术,无需用非特异性免疫原如ConA,PHA等刺激分离的脾淋巴细胞,直接提取总RNA,扩增固始鸡IL-18基因,并进行克隆和测序.测序结果:获得了固始鸡IL-18基因全序列,其大小为597 bp;序列比较分析发现,克隆的固始鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列核苷酸同源性为99.8%,有1个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为99.5%;固始鸡与人和其他动物的IL-18基因序列分析和系统进化分析表明,IL-18基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.

鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达

为使鸡IL-18成熟蛋白基因在真核系统中高效表达,对其进行定点突变,将酵母低频密码子突变为偏嗜性密码子,构建了鸡IL-18成熟蛋白变构基因真核重组表达载体pPICZαA-MChIL18*,并将其转化入P.pastorisX-33。重组菌株X-33/pPICZαA-MChIL18*经甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE检测,结果在约23 000处有目的条带,与预期的相对分子质量一致,占总蛋白的45%,对其进行Western-blot检测,结果与兔抗鸡IL-18多克隆抗体发生特异性免疫反应。结果表明,鸡IL-18成熟蛋白变构基因在毕赤酵母中成功的进行了表达。

NDV F基因真核表达质粒的构建及其与鸡IL-18基因联合免疫的初步研究

为了探索鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白的免疫原性及鸡白细胞介素-18(IL-18)的免疫增强作用,通过PCR和酶切方法将NDV F基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA-F。用质粒pcDNA-F单独或与鸡IL-18重组真核表达质粒pIL-18联合免疫14日龄SPF鸡。首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第14 d用NDV强毒F48E9株进行攻击。结果表明,质粒pcDNA-F与pIL-18联合免疫显著提高鸡体的细胞免疫水平,并且提供了50%免疫保护,这为ND的防治开辟了新的途径。

重组鸡白介素18真核表达质粒(pCI-ChIL-18)胚胎接种的研究

通过对孵化率、平均囊指数、脾指数、外周血淋巴细胞增殖反应和白介素18(IL-18)蛋白水平表达的检测,评定了重组鸡真核表达质粒(pCI-ChIL-18)胚胎接种的不同接种剂量和接种方法的效果。结果表明,pCI-ChIL-18质粒接种18日龄鸡胚不影响孵化率,对鸡的生长发育无影响,不同的接种途径和接种剂量对鸡体内IL-18的表达有影响。与1日龄雏鸡肌肉接种比较,胚胎接种可明显促进外周血淋巴细胞的早期增殖,而且呈剂量依赖性,但相同接种途径的200μg接种组与300μg接种组间无统计学差异(P>0.05)。

海兰鸡IL-18全基因的克隆与序列分析

IL-18是一种能诱导产生IFN-γ的新型细胞因子,在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。根据GenBank发表的鸡IL-18cDNA基因序列,自行设计一对引物,经植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾淋巴细胞后,提取其总RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,扩增产物进行了T-A克隆、测序,获得了中国海兰鸡IL-18基因全序列,其大小为597 bp,与GenBank中查得的鸡IL-18基因进行比较发现,中国海兰鸡IL-18基因与Schneider报道的鸡IL-18基因序列完全一致,为进一步研究鸡IL-18基因表达、生物学活性和应用奠定了基础。

鸡IL-18基因的克隆表达及对新城疫疫苗诱导的HI抗体变化的研究

通过RT-PCR方法从新城疫Ⅰ系疫苗诱导的11日龄鸡胚脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到ChIL-18全基因,其编码区大小为597bp,编码198个氨基酸多肽。将该基因片段克隆到原核表达载体pProEXTMHTb构建重组质粒pProEXTMHTb-ChIL-18转化大肠杆菌DH5α中,并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子量为28.6ku的重组蛋白。观察ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体动态变化。结果表明,同时接种ChIL-18蛋白和活疫苗的免疫鸡在接种后,所产生的HI抗体效价高于PBS和活疫苗免疫组,并且,HI抗体效价在15d及热应激24h时表现差异显著(P<0.05)。表明ChIL-18蛋白对新城疫疫苗诱导的HI抗体有增强作用。

鸡IL-18重组真核表达载体的构建及其对ND灭活苗的佐剂作用

从pGEM-ChIL-18克隆质粒扩增获得鸡IL-18(ChIL-18)全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pChIL-18)。经PCR、酶切和基因测序证实,所获重组质粒含有目的片段,且连接、构建正确。pChIL-18转染Cos7细胞,转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。pChIL-18对ND灭活苗免疫增强作用的研究表明pChIL-18能够提高ND灭活苗诱发的细胞免疫应答,为后续基因疫苗的研究奠定基础。

鸡IL-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性

从pMDChIL18克隆质粒扩增获得了ChIL18全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切、质粒PCR鉴定和基因测序,鸡IL18全基因被正确重组到pcDNA3.1(+)真核表达质粒上;将重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)ChIL18转染COS7细胞,转染细胞中含ChIL18基因的mRNA。SDSPAGE分析表明,表达产物是与ChIL18相符的约23ku的蛋白条带。鸡淋巴细胞转化试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。

鸡白细胞介素-18在鸡球虫病疫苗免疫中的作用

为了探索鸡白细胞介素-18(IL-18)在鸡球虫病疫苗免疫中的免疫佐剂作用,用鸡IL-18的重组真核表达质粒pIL-l8、柔嫩艾美耳球虫早熟株疫苗及两者联合分别接种3日龄鸡,首免后第1 d、4 d、6 d、9 d、14 d、21 d、26d、28 d时随机抽取鸡外周血及无菌采取鸡脾脏,应用ELISA和甲基噻唑基四唑(MTT)法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第14 d用柔嫩艾美耳球虫进行攻击。结果表明,pIL-18与鸡柔嫩艾美耳球虫早熟株疫苗联合免疫具有明显提高虫苗免疫保护的作用,pIL-18单独注射鸡体也具有明显增强鸡体抗球虫感染的作用。表明鸡IL-18能够明显增强鸡球虫病疫苗的免疫原性,显著提高免疫鸡的体液免疫和细胞免疫水平,并且能强有力地抵抗柔嫩艾美耳球虫的攻击。

鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及分子进化分析

根据已发表的鸡白介素18(IL-18)基因序列设计合成引物,以植物凝集素(PHA)和脂多糖(LPS)激活的AA肉鸡脾细胞mRNA为模板,通过RT-PCR扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白的cDNA。将该cDNA克隆于pUCm-T载体,并对其进行测序,结果表明所克隆的核苷酸片段包含了全部成熟蛋白编码基因,成熟蛋白编码区507个核苷酸,编码169个氨基酸。把该基因编码的鸡成熟IL-18蛋白氨基酸序列与已公布的禽及哺乳动物IL-8成熟蛋白基因氨基酸序列进行比较,其同源性分别在96.5%～100%和20.1%～26.6%之间。分子系统进化树分析表明鸡IL-18与哺乳动物IL-18有共同的祖先,亲源关系较近,但在免疫系统选择性压力下,形成独特的种族特异性。鸡IL-18基因的克隆为体外表达鸡IL-18蛋白及作为免疫佐剂应用于预防接种的研究奠定了基础。