鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离及鉴定

本试验从天津某鸡场、呼和浩特市两个鸡场发病鸡群分离到３个肾型ＩＢＶ毒株，分别命名为Ｔ、Ｈ、Ｗ株，并对其培养特性、形态特性、血凝性、致病性、对新城疫病毒的干扰性等方面进行研究。结果表明，３个毒株很快适应于鸡胚，引起鸡胚出血、萎缩、绒毛尿囊膜增厚；３个毒株也适应于鸡胚肾、肺细胞，适应性有差异；病毒增殖后制负染样品，在电镜下观察，可看到直径约１００ｎｍ左右，病毒囊膜外有疏松刺突的冠状病毒。用接毒的肾、肺细胞制成超薄切片后电镜下观察，可看到胞浆内的典型的ＩＢＶ；分离株对鸡的红细胞无凝集性，但用１％胰酶处理后表现不同程度的血凝性；３个分离株均能抑制鸡新城疫病毒Ｂ＿１株在鸡胚中繁殖；分离株回归４２日龄雏鸡后从第３天开始发病，发病率为１００％，病死率为６０－９０％。

鸡传染性法氏囊病野毒株的分离鉴定及河北弱毒株培育的研究

从河北省６个地区鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）的鸡群中，分离到６株强毒，均能使易感鸡３６小时发病并死亡，发病率达６０～１００％，死亡率１０～７０％。人工感染鸡能见到与野外病例相同的病变。经血清学试验、鸡胚接种、电镜观察均证明，分离物为传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ），其中有的毒株，毒力非常强。利用其中毒力最强的１株病毒，经鸡胚多次传代培养育成１株免疫原性好，免疫期长，免疫效果容易监测的弱毒株，经野外试验证明，该毒株是防治ＩＢＤ的一个很理想的毒株。

鸭瘟鸡胚化弱毒株细菌人工染色体的构建与鉴定

为了构建鸭瘟鸡胚化弱毒株DEV(atten)的细菌人工染色体(BAC),将转移载体质粒pDEVgC-pHA2DNA和DEV(atten)DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行重组,通过三轮挑斑纯化,以获得纯化的鸭瘟重组病毒。将纯化的鸭瘟重组病毒的DNA电转化到E.Coli DH10B中,对获得的克隆用酶切、PCR方法进行鉴定并测序。提取阳性克隆的DNA转染CEF,以拯救重组病毒。再通过将带有相同同源臂和UL44(糖蛋白质C,gC)基因的片段和阳性克隆的DNA共转染鸡胚成纤维细胞进行重组,以获得gC恢复病毒。采用0.01感染复数(MOI)感染CEF对亲本病毒、恢复病毒进行多步法生长曲线测定,比较其有无差异。结果显示:成功获得了DEV的mini-F重组病毒,命名为DEV(atten)-mini-F,获得2个阳性克隆S1、S2,将S1命名为pDEV(atten),应用pDEV(atten)拯救重组病毒获得gC恢复病毒DEV(atten)ΔgC-R,生长特性的结果显示亲本病毒与恢复病毒间无显著性差异。表明成功构建的DEV(atten)的细菌人工染色体为全基因组的感染性克隆。

Ⅰ型鸭肝炎病毒(MY株)活疫苗毒种的纯粹及生产条件探索

将Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株进行纯粹检验；以100ELD50 0．2mL／枚（含病毒3．0×10^5个拷贝）剂量经鸡胚尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每隔12h观察并采集鸡胚胚体和尿囊液样本，运用自行建立的检测DHV-1的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法检测MY株弱毒的鸡胚增殖规律．结果表明，该毒种符合我国的兽用生物制品规程，毒种纯粹；病毒接种后，鸡胚死亡时间主要集中在48-53h；病毒在感染后的12h，24h，36h，48h和53h时段，鸡胚尿囊液中病毒拷贝数为：3．28×10^2、5．28×10^3、7．01×10^3、3．31×10^5和4.42×10^5；鸡胚胚体病毒拷贝数为：8．46×10^3、1．91×10^6、3．41×10^6、1．36×10^7和1．03×10^7;显示，MY株弱毒经鸡胚尿囊腔接种鸡胚，病毒在胚体中的拷贝数在各时间均高于尿囊液中的拷贝数，且在48-53h达到高峰（1．36×10^7-1．03×10^7）．因此，用鸡胚繁殖MY株弱毒，应以收获鸡胚胚体为主要毒源，收毒时间以鸡胚尿囊腔接种后48～53h为佳．为运用MY株生产Ⅰ型鸭病毒性肝炎弱毒疫苗奠定了基础．

银翘散精简方、玉屏风散提取物在鸡胚中抗甲型流感病毒FM1株阻断与抑制作用研究

目的观察银翘散精简方、玉屏风散提取物在鸡胚内抗病毒阻断和抑制的作用。方法采用鸡胚实验技术观察银翘散精简方、玉屏风散提取物对甲型流感病毒FM1株的阻断和抑制作用。结果流感病毒鸡胚半数感染量EID50为10-6;银翘散精简方、玉屏风散提取物对鸡胚最大无毒浓度分别为大于39.15、36.2g/L,利巴韦林最大无毒剂量为100g/L。银翘散精简方提取物对甲型流感病毒FM1株毒力阻断作用:半数有效量(ED50)为7.41g/L,治疗指数(TI)大于5.28,浓度为19.58g/L时鸡胚未感染率为100%,优于其他浓度(P<0.05);银翘散精简方提取物对甲型流感病毒FM1株毒力抑制作用:ED50为9.91g/L,TI大于3.95,浓度为39.15g/L时鸡胚未感染率为100%,优于其他浓度(P<0.05)。玉屏风散提取物对甲型流感病毒FM1株毒力阻断作用:ED50为9.57g/L,TI大于3.78,浓度为36.2g/L时鸡胚未感染率为100%,优于其他浓度(P<0.05);玉屏风散提取物对甲型流感病毒FM1株毒力抑制作用:ED50为10.38g/L,TI大于3.3,浓度为36.2g/L和18.1g/L时(两者毒力抑制作用均等)鸡胚未感染率为83%,优于浓度9.05g/L(P<0.05)。提取物在鸡胚死亡阻断观察上,在对毒力阻断作用时玉屏风散提取物优于银翘散精简方提取物,在对毒力抑制作用时银翘散精简方提取物优于玉屏风散提取物。各提取物对甲型流感病毒FM1株毒力阻断和抑制作用优于利巴韦林组(P<0.05)。结论银翘散精简方、玉屏风散提取物对甲型流感病毒FM1株有阻断和抑制作用。

细胞微载体培养技术用于鸡胚原代细胞培养及鸡新城疫病毒的增殖

以细胞微载体培养技术,用DEAE-Sephadex A 50,Cytodex 3二种微载体,对鸡胚原代细胞进行培养研究,并用在微载体上培养的鸡胚细胞感染鸡新城疫Ⅰ系毒,制备鸡新城疫Ⅰ系细胞苗免疫鸡,与普通细胞培养及鸡胚增殖病毒制备的鸡新城疫Ⅰ系苗比较,我们得到了在微载体培养系统有较高的细胞产量,较高的病毒滴度,培养物制备疫苗抗原性也好的结果。

鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1重组蛋白的免疫保护效果试验

将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Vp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通过动物攻毒试验评价免疫保护效果。结果显示:Vp1重组蛋白免疫家兔后血清检测琼扩效价≥1∶64,细胞中和试验效价为1/45;雏鸭免疫后抗体生成水平呈明显上升趋势,对攻毒起到了保护作用。首次揭示了DHAV-1结构蛋白Vp1刺激机体产生抗体使雏鸭获得保护的能力。

雏鸭人工接种鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY后组织结构动态变化的比较研究

对鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY接种4日龄雏鸭后的组织变化进行了动态观察比较研究。结果显示:雏鸭接毒12 h肝、肾呈现轻度细胞变性;48 h后组织变性程度减轻,汇管区周围细胞增生;144 h细胞核、浆染色加深,组织修复迹象明显;14 d结构正常。接毒12 h脾脏白髓、法氏囊滤泡中淋巴细胞减少,72 h脾、24 h法氏囊中淋巴细胞有所增多。心脏、肺、脑组织在接毒各期皆有轻度的充血、出血。鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY与标准毒导致的多组织变性、坏死相比,其变性轻而可逆;与疫苗HY所致的组织变化相似,但结构恢复时间早。结果表明:鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY接种4日龄雏鸭,虽可造成雏鸭肝、肾等实质器官轻微的组织病变,但损伤的组织结构可在短期内修复,并恢复至正常;脾脏、法氏囊中的淋巴细胞在接毒后,也由减少到增多。本研究为鸭肝炎鸡胚化弱毒株MY用作鸭肝炎疫苗株的安全性从病理组织学角度提供了依据。

雏鸭接种Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株后血清生化指标的动态变化

用Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株人工接种4日龄雏鸭，于接种后第6、12、24、48、72、96、144、168、192h及14d采集接种鸭的血液，分离血清，进行生化指标测定，并与同期接种的弱毒疫苗HY、标准毒及对照组的血清生化指标进行比对。与对照组比较：MY组和HY组的白蛋白在接种后24h明显降低，48h差异极显著；血清谷丙转氨酶于24h、144h时段明显升高，且MY组持续至192h。标毒组则表现为接毒后，血清葡萄糖于24～96h降低，甘油三酯于72h、192h显著升高；血清总蛋白72h、96h、144h，白蛋白24—144h，球蛋白72～96h，144h明显降低；谷丙转氨酶于24～192h，血清谷草转氨酶在24～72h显著升高；尿酸72h呈一过性升高。结果表明，感染Ⅰ型鸭肝炎鸡胚化弱毒MY株与弱毒疫苗HY的血清生化变化规律相似。

新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞中免疫相关细胞因子表达的检测

分别采用新城疫强毒株F48E9与新城疫弱毒株LaSota感染10日龄鸡胚制作的鸡胚成纤维细胞,感染后24h提取鸡胚成纤维细胞的总RNA,通过RT-PCR技术结合凝胶成像系统扫描检测21种免疫相关细胞因子在鸡胚成纤维细胞中的表达量。实验结果表明,在鸡胚成纤维细胞中,无论是否感染新城疫病毒,IL-2、IL-3、IL-4、IL-21不能检测到其相应条带。通过统计学分析,IFN-β、IFN-γ、IL-9、IL-12-P35、IL-12-P40在病毒感染组与对照组间呈现出显著的差异,而强毒感染组与弱毒感染组的比较中,仅IFNγ、IL-9表现出显著差异。

鸡新城疫La Sota株、鸡传染性支气管炎W_(93)株二联活疫苗研究 Ⅱ.接毒剂量选择试验

将鸡新城疫LaSota毒种和嗜肾型鸡传染性支气管炎W93毒种分别用生理盐水做适当稀释后,将两种病毒液等量混合,接种于同一SPF鸡胚尿囊腔内。结果表明,IBV、NDV在同一鸡胚内增殖时无互相干扰现象;收获的鸡胚液(LaSota+W93)中NDV、IBV的效价分别达到相应单苗水平。

机械牵拉对胚胎鸡心肌细胞大电导钾通道生物物理特性的影响

为了研究鸡心肌细胞BK通道对持续外加牵拉力的生物物理敏感性,从而了解心肌肥大和心力衰竭的发病机制,试验采用基底牵拉装置,对表达有克隆于胚胎鸡心肌细胞BK通道α亚基和共表达α、β亚基的胚胎鸡心肌细胞CHO-K1分别持续施加10%的拉伸应变24 h,应用单通道记录分析β亚基和钙离子在拉伸应变对BK通道生物物理特性影响中的作用。结果表明:拉伸应变作用于CHO-K1细胞后使通道的力敏感性明显增加,但牵拉对通道的钙离子依赖性影响不明显,而在此过程中β亚基并不起显著的作用。说明心脏在收缩、舒张时,心肌细胞由于遭受大的变形而产生力学作用,当这个力的作用超负荷时,会造成心肌肥大、心率不齐等一系列病变。

DHAV-3适应鸡胚毒株的培育及特性测定

旨在培育鸭甲型肝炎病毒血清3型(DHAV-3)适应鸡胚毒株并对其特性进行研究。利用鸭胚从临床病料中分离得到的DHAV-3 LC强毒株经卵黄囊接种鸡胚传代、纯化获得适应鸡胚毒株,并对毒株的致病性、毒力稳定性、免疫原性和基因组特征进行测定。结果显示,利用鸭胚接种成功从病料中分离鉴定DHAV-3 LC强毒株,对鸭胚和雏鸭的半数致死量分别为10-6.20/0.2 mL和10^(-4.25)/0.2 mL。经卵黄囊接种鸡胚69代,获得适应鸡胚毒株DHAV-3 CA。CA株的F4、F16、F21、F31、F41和F51代病毒液的ELD50分别为10^(-6.44)/0.3 mL,10^(-6.60)/0.3 mL,10^(-7.44)/0.3 mL,10^(-7.80)/0.3 mL,10-7.43/0.3 mL和10^(7.25)/0.3 mL;各代病毒对1日龄雏鸭不致病,但在体内连续传代出现接种雏鸭死亡。F21代病毒制备的油包水灭活疫苗免疫蛋鸡,血清中和抗体效价达1∶500以上;以2.5×10^(4.8)ELD50及以上剂量的F31代病毒经颈部皮下接种1日龄雏鸭,攻毒保护率均在90%以上。F21代病毒全基因组序列分析显示,与DHAV-3 LC相比,基因组内无碱基插入或缺失,但有32个位点发生碱基突变;VP0基因的C1410T和A1411G突变与病毒在鸡胚中的传代次数有相关性。本试验成功培育出适应鸡胚毒株DHAV-3 CA,具有良好的免疫原性,但存在致病性返祖现象。

2017—2018年北京市东城区新甲型H1N1流感病毒HA基因特征研究

目的了解2017年4月1日—2018年3月31日期间北京市东城区新甲型H1N1流感病毒流行特征,并分析细胞株和鸡胚株血凝素(HA)基因遗传变异情况。方法收集2017年4月1日—2018年3月31日期间北京市东城区流感数据,分析新甲型H1N1流感的流行特征;用实时荧光PCR(RT-PCR)方法对选取的7株新甲型H1N1细胞分离株和其相对应的7株鸡胚株进行HA基因序列扩增并测序,用DNASTAR 5.0和MEGA 6.0软件对测序结果进行系统进化树和遗传特征分析。结果2017年4月1日—2018年3月31日期间在北京市东城区共检测样本1780份,新甲型H1N1阳性99份,阳性率是5.56%,细胞分离出新甲型H1N1为51株,鸡胚株为15株。测序成功的13株毒株与世界卫生组织(WHO)推荐的北半球疫苗株A/Michigan/45/2015(甲型/密歇根/45/2015)在系统进化树上位于同一大分支上,同源性较高。其核苷酸同源性为98.96%~100.00%,氨基酸同源性为97.92%~100.00%。其中S74R、P137S、S164T、S183P、T185N、T216K、I267T共7个氨基酸位点(包含抗原决定簇位点)发生改变,决定流感毒力的D222位点和二硫键未发生改变。结论目前北京市东城区新甲型H1N1流感病毒与疫苗株匹配性较高,但是其HA序列中氨基酸位点变异仍存在,要长期从分子水平进行监测,预防新甲型H1N1流感发生大流行。

狂犬病病毒在鸡胚成纤维细胞上的传代适应性

目的探讨狂犬病病毒(Rabies virus,RV)aG株在原代鸡胚成纤维细胞上的传代适应性。方法将RV北京株固定毒10aG株豚鼠脑毒种在鸡胚成纤维细胞上连续传代培养,显微镜观察细胞的形态变化,ELISA检测各代次收获液中的病毒量,取11、21、31代病毒收获液,小鼠脑内毒力测定法检测病毒滴度。利用正交试验筛选最适病毒培养条件,以筛选的最佳比例接种病毒,绘制病毒生长曲线,并进行特异性及免疫原性检测。结果狂犬病病毒aG株感染鸡胚成纤维细胞未观察到明显的细胞病变效应,随着传代次数的增加,病毒含量呈上升趋势,11、21、31代病毒收获液的滴度分别为4.0、7.7和7.17 LogLD50/ml;多次传代后,最适培养条件为细胞浓度150×104个/ml、接种比例1∶500、血清浓度2%、收获时间为5 d;病毒连续收获3次后,细胞开始脱落,经检测其病毒滴度可达7.0 logLD50/ml以上,中和指数可达8 500,第21代病毒制备成的试制疫苗效价为2.0 IU/ml。结论 RV北京株固定毒10 aG株豚鼠脑毒种可适应于鸡胚细胞培养,为鸡胚细胞狂犬病疫苗的研究奠定了基础。