云南烟草产区辣椒脉斑驳病毒的调查及其遗传多样性分析

明确辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)在云南6个州(市)烟草生产区的分布、遗传多样性和群体遗传结构,对病害的防控预警具有重要意义。本研究以2022年采集自云南6个州(市)不同烟草产区的96份疑似感染ChiVMV的烟草样品为试验材料,利用电子显微镜负染色观察和分子生物学方法对病毒进行检测和鉴定,获得21个ChiVMV云南烟草分离物的cp基因序列。利用SDT、MEGA、RDP、DnaSP及Arlequin等生物学软件对21个云南烟草分离物及NCBI上下载的38个来自不同国家、地区及寄主的ChiVMV分离物cp基因序列的系统进化、遗传多样性和群体遗传结构特征进行分析。结果显示,从云南6个州(市)烟草生产区采集的96份烟草样品中,ChiVMV检出率为51.04%;序列比对发现,本研究获得的cp基因与NCBI中38个ChiVMV分离物cp基因的核苷酸一致性在84.1%以上;系统发育分析发现,59个ChiVMV分离物按照地理位置的远近被划分为4个分支,聚类结果具有明显的地理分布特征,而与寄主植物无关;遗传多样性和遗传分化分析表明,4个地理种群的ChiVMV cp基因遗传多样性水平均较高,中国种群与印度、泰国和其他国家种群间发生了很大的遗传分化且差异显著(P<0.05);遗传力分析显示,基因交流、遗传漂变和基因的负选择压力是ChiVMV分离物适应性进化的重要方式。

辣椒脉斑驳病毒外壳蛋白多克隆抗体的制备和应用

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是茄科植物生产上危害最严重的病毒之一,也是口岸检疫的对象。本研究旨在制备特异性强的ChiVMV外壳蛋白的多克隆抗体并用于田间病株的检测。【方法】通过RT-PCR方法扩增ChiVMV贵州烟草分离物外壳蛋白基因的全长(861 bp)和部分片段(396 bp),分别重组至原核表达载体pET28a中,转化Escherichia coli BL21后进行诱导表达,表达产物层析分离和透析纯化后免疫大耳兔制备多克隆抗体,最后使用酶联免疫吸附法(ELISA)、Western blot等方法检测抗体效价和特异性。【结果】成功制备了ChiVMV外壳蛋白的两种多克隆抗体antiCP^(1-287aa)、antiCP^(1-132aa),抗体效价分别为1∶6400、1∶12800;两种抗体antiCP^(1-287aa)、antiCP^(1-132aa)均能通过Western blot方法检测到抗原;田间病株的间接ELISA检测显示,antiCP^(1-132aa)能特异性检测ChiVMV病株,未能检测到马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病株,而antiCP^(1-287aa)无法区分这两种病株。【结论】多克隆抗体antiCP^(1-132aa)的特异性较强,可用于ChiVMV田间病株的检测,也为ChiVMV外壳蛋白的功能研究奠定基础。

侵染贵州烟草的辣椒脉斑驳病毒鉴定及其基因组分子特征分析

【目的】明确辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)在贵州烟草上的发生情况及其与我国其他省份不同ChiVMV株系之间的遗传进化关系,为制定科学合理的防控措施提供依据。【方法】从贵州省贵阳、遵义、安顺和铜仁的烟田采集表现叶片斑驳、皱缩、坏死和花叶等症状的疑似病毒侵染的烟叶样品80份。采用RT-PCR法,设计多种病毒引物对所采集的样品进行检测,对检测出的ChiVMV进一步进行PCR分段扩增以获得贵州烟草ChiVMV的全基因组序列,基于NCBI已公布的所有ChiVMV基因组序列进行序列一致性分析并构建系统发育进化树,以研究贵州ChiVMV烟草分离株的遗传进化关系。【结果】RT-PCR检测结果显示,ChiVMV在贵州烟区检出率为37.50%,烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)检出率为48.75%,马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的检出率为35.00%,黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)检出率仅8.75%;检测出4种复合侵染类型TMV+PVY、PVY+ChiVMV、PVY+CMV和ChiVMV+PVY+TMV,检出率分别为26.25%、6.25%、10.00%和3.75%。PCR分段扩增获得贵州省烟草分离株ChiVMV-GZ(GenBank:OP589298),其与来自四川的番茄分离株(KC711055)和四川烟草分离株(MK405594)具有较高的序列一致性(98.70%和98.50%);构建系统发育进化树发现其与来自四川和云南的ChiVMV株系聚为一支。【结论】辣椒脉斑驳病毒在贵州烟草上的为害已日趋严重,应当引起足够重视,本研究在贵州烟草上分离获得分离株ChiVMV-GZ并扩增获得该病毒全基因组;基于遗传进化分析发现,ChiVMV-GZ与来自四川和云南的ChiVMV株系间的亲缘关系最近。

烟草辣椒脉斑驳病毒病的发生与防治技术研究进展

辣椒叶脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)为严重危害茄科植物的一种(+)ssRNA病毒,可侵染辣椒、番茄、茄子、烟草等。该病毒具有较强的致病性和破坏性,侵染烟草后会诱发系统性叶片枯斑坏死,导致烟草叶片自下而上干枯脱落甚至整株死亡。本文总结了烟草辣椒脉斑驳病毒病的传播方式和感染特征,并从农业防治、物理防治、化学防治和生物防治等方面综述了烟草辣椒脉斑驳病毒病的防治措施研究进展,以期为有效控制烟草辣椒脉斑驳病毒病提供参考。

南美红辣椒脉斑驳病毒RT-LAMP检测体系的建立及优化

南美红辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是一种严重危害茄科作物的正单链RNA病毒,也是云南烟草上的主要病毒之一。本研究采用单一变量法,建立并优化检测ChiVMV的反转录环介导等温扩增(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)体系。对RT-LAMP的反应时间、反应温度及体系中Mg 2+、dNTPs、甜菜碱浓度和内外引物浓度比进行优化,同时用RT-PCR对优化后的RT-LAMP检测体系进行灵敏度验证。结果表明,最佳引物组为CH-CP-3,在25μL反应体系中各组分最佳加入量为:缓冲液2.5μL,MgSO 4(100 mmol/L)0.5μL,dNTPs(10 mmol/L)0.5μL,FIP/BIP(10 mmol/L)2μL,F3/B3(10 mmol/L)0.5μL,LF/LB(10 mmol/L)1.5μL,甜菜碱(5 mmol/L)5μL,Bst 2.0 WarmStar DNA Polymerase(8000 U/mL)0.5μL,M-MLV酶(10000 U/mL)0.125μL,RNA(≥50.7 fg)1μL,DEPC H 2O补至25μL;最佳反应温度及时间为63℃50 min,优化后的RT-LAMP检测结果与RT-PCR检测结果一致,且其灵敏度是RT-PCR的100倍。本研究建立的ChiVMV RT-LAMP检测方法具有快速、灵敏和操作简便等优点,为开发ChiVMV RT-LAMP检测试剂盒及其实际应用提供了重要基础。

辣椒脉斑驳病毒文昌分离物基因组测序及分析

辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)近年来严重危害海南黄灯笼辣椒的产量,开展针对该病毒的研究以求达到对其有效防控迫在眉睫。本研究分7段克隆了ChiVMV文昌分离物(ChiVMV Wenchang isolate,ChiVMV-WC)的基因组。分段克隆的测序结果通过拼接,共获得ChiVMV-WC基因组9717个核苷酸(nt)序列(GenBank登录号:GQ981316)。在核苷酸序列的第164位～第9270位存在一个大的开放阅读框(ORF),编码一个多聚蛋白(分子量为350.44kD)。近年来被证实的马铃薯Y病毒科的一个新的ORF(pretty interesting potyviridae ORF,PIPO)存在于ChiVMV-WC基因组核苷酸序列的第2892位～第3110位,编码一个由72个氨基酸聚合而成的多肽(分子量为8.26kD)。ChiVMV-WC与ChiVMV其它分离物的基因组核苷酸序列比较发现该病毒存在着较高的变异率。本研究通过与同属内病毒的同源性分析以及系统进化树分析,确定了ChiVMV-WC在生物进化史上的地位。

烟草品种辣椒叶脉斑驳病毒病的症状与抗病性鉴定

辣椒叶脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)为马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的确定种,在我国烟草上的危害呈上升趋势,了解ChiVMV侵染烟草品种的症状和品种的抗性有利于病害防治。本文通过塑料大棚内摩擦接种,分析了21个烟草品种的症状特征和对ChiVMV的抗性。ChiVMV侵染烟草的典型症状为褪绿黄化、花叶、疱斑和叶缘下卷。按照国家标准GB/T 23224—2008,依据接种ChiVMV后14 d的平均病情指数,各品种对ChiVMV的抗性分别为:MD609,巴斯玛1号和云烟97为感病,MSK326,MS云烟87,MS云烟85,红花大金元等18个供试品种为高感。云南省烟草主栽品种缺乏对ChiVMV的抗性,ChiVMV的危害需要引起重视。

辣椒脉斑驳病毒的多基因联合检测与鉴定

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-PCR方法对印度进境辣椒进行检测以确定是否携带有ChiVMV。根据ChiVMV外壳蛋白(coat protein,CP)和圆柱状内含体蛋白(cytoplasmic inclusion protein,CI)保守区域分别设计引物,筛选两个基因(CP和CI)的特异性引物组合,通过设定不同的引物用量组合以及对退火温度等条件进行优化,探索最佳的反应条件,建立多基因联合检测方法。利用建立的多基因联合检测体系对包含ChiVMV在内的辣椒病毒进行检测,以验证该体系特异性。同时对ChiVMV阳性样品的不同浓度cDNA进行扩增,测定其检测灵敏度。此外,对田间辣椒样本进行检测,以验证体系的实际应用效果。【结果】通过对印度进境辣椒的DAS-ELISA检测,发现样品提取液与ChiVMV呈阳性反应;利用CP861-F/CP861-R特异性引物对进行RT-PCR,扩增出与预期大小相一致的特异性片段,确认该批辣椒样品携带有ChiVMV。多基因联合检测体系中,应用引物对CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R分别扩增出长度为337、655 bp的特异性目的片段。经优化后的反应体系和程序为cDNA 2μL、CP337-F/CP337-R各0.625μL(10μmol·L-1)、CI655-F/CI655-R各1.375μL(10μmol·L-1)、2×PCR Master Mix12.5μL、ddH2O 6.5μL,退火温度50℃,共35个循环。建立的多基因联合检测方法具有良好的特异性和灵敏度,两个基因检测灵敏度均为10-4数量级。实际应用检测结果表明,该方法可从感染ChiVMV的样品中同时扩增出CP和CI的特异性目的片段。【结论】建立的多基因联合检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,可为辣椒脉斑驳病毒的快速检测提供可靠的技术支持。

贵州辣椒脉斑驳病毒的检测及株系分化研究

【目的】明确贵州辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,Chi VMV)的分布和遗传进化情况,为该病毒的基因功能及其与宿主植物互作关系研究提供科学依据。【方法】采用反转录PCR(RT-PCR)对采自贵州贵阳、遵义、黔西和大方的疑似Chi VMV辣椒样品进行扩增并测序;运用DNAMAN和MEGA对Chi VMV CP基因和和3'-UTR进行序列拼接及分析,并构建系统发育进化树。【结果】从39份疑似Chi VMV辣椒样品中检测出7份阳性样品,检出率为17.95%。将贵州Chi VMV株系的部分CP基因和3'-UTR序列在NCBI中进行核苷酸序列比对,发现其与来源于四川辣椒上的Chi VMV株系的同源性最高,为99%,与我国其他省份Chi VMV株系同源性大于90%;构建的系统发育进化树表明贵州株系与四川和云南株系亲缘关系最近。【结论】贵州Chi VMV株系存在明显的株系分化现象。

ChiVMV在滇重楼上的首次发现及部分基因序列分析

滇重楼(Paris yunnanensis)是主要分布在我国西南地区尤其是云南的珍贵药材。2016年,从云南省德宏州芒市的滇重楼种植基地上观察到叶片斑驳、皱缩、坏死和花叶的滇重楼罹病植株。利用马铃薯Y病毒属(Potyvirus)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、黄症病毒属(Luteovirus)和菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)病毒的通用引物和重楼X病毒(paris polyphylla virus X,PPVX)的特异引物,对采集的13份滇重楼样品进行病毒检测,结果发现利用马铃薯Y病毒属的通用引物CIFor/CIRev,能从罹病植株中扩增到与引物设计相符的条带。将目标产物克隆、测序,结果显示与辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus, ChiVMV)云南烟草分离物在ci基因核心区域具有99%的核苷酸序列一致性,表明染病滇重楼有ChiVMV的侵染。利用ChiVMV的特异引物,对2016-2018年采自云南省保山市龙陵县、德宏州芒市、怒江州泸水县、丽江市古城区、迪庆州香格里拉市和四川省攀枝花市盐边县的93份滇重楼样品进行RT-PCR检测,结果除泸水县采集的8个样品没有检测到ChiVMV外,其他5个地区采集的85个样品中有25个检测到ChiVMV的侵染。将ChiVMV丽江分离物及迪庆分离物的PCR产物进行克隆和测序,序列分析显示2个ChiVMV滇重楼分离物(YLJ-CL1,MW408193;YDQ-CL1,MW404246)在部分NIb基因及完整cp基因共1 269 nt的区域,具有相互间100%的核苷酸序列一致性,以及与ChiVMV其它分离物相应区域82.4%~99.1%的核苷酸序列一致性。利用不同ChiVMV分离物中该区域1 269 nt核苷酸序列构建的系统发育树,表明侵染滇重楼的ChiVMV分离物与侵染云南烟草的ChiVMV分离物亲缘关系最近。这是ChiVMV在重楼属(Paris)乃至黑药花科(Melanthiaceae)植物上的首次报道。

贵州省安顺烟区烟草主要病毒种类及复合侵染类型分析

为明确贵州省安顺烟区烟草主要病毒毒源种类和侵染类型,2023年从安顺烟区采集表现为花叶、叶脉扭曲坏死、畸形、闪电斑和斑点黄化等症状的烟草样品306份,并利用烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)5种主要病毒病特异性引物进行RT-PCR扩增检测,统计病毒的检出率并分析复合侵染类型。结果显示:总病毒检出率为89.87%。其中,TMV占比最高,为81.70%;ChiVMV次之,为67.97%;CMV占比最低,为16.34%。复合侵染是主要的侵染类型,检出率为68.30%。其中,ChiVMV+TMV类型占比最高,为22.88%,其次是ChiVMV+TMV+TVBMV、ChiVMV+TMV+PVY和ChiVMV+TMV+CMV 3种类型,分别占11.11%、10.46%和9.15%。贵州省安顺烟区烟草病毒病的优势毒源为TMV和ChiVMV,复合侵染普遍发生,以ChiVMV+TMV复合侵染类型为主。

ChiVMV四川分离物的分子鉴定及致病性初步研究

从四川感病的辣椒上分离得到了辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)的一个分离物Pp3.利用RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)的方法克隆这个分离物的外壳蛋白(coat protein,CP)基因,测定了它的核苷酸序列并进行序列分析.结果表明Pp3的CP基因含有861个碱基,与迄今已报道的其它辣椒脉斑驳病毒分离物CP基因的序列一致性为80.0%～88.0%.基于辣椒脉斑驳病毒CP基因核苷酸序列的分子进化树显示,Pp3与其它分离物的差异较为显著.利用模式植物烟草对Pp3的致病性特征进行了初步的研究,结果显示Pp3具有较强的致病性,能导致烟草产生系统性坏死症状.

贵州黔西南烟草中辣椒脉斑驳病毒的鉴定及遗传多样性分析

为明确贵州黔西南烟草中辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)的遗传多样性和分子进化特征,本研究以2021—2022年采集自贵州省黔西南州兴义市的52份疑似感染ChiVMV的烟草样品为实验材料,利用马铃薯Y病毒属(Potyvirus)通用引物和ChiVMV特异性引物进行RT-PCR检测、克隆和测序,并结合GenBank中已公布的相关序列对分离获得的16个ChiVMV贵州烟草分离物进行基于外壳蛋白(coat protein,CP)CP基因的遗传多样性和分子进化分析。结果显示,所获得的ChiVMV贵州烟草分离物与GenBank中其他36个分离物CP基因的核苷酸一致性为84.79%~99.65%;基于ChiVMV CP基因的系统进化分析发现,52个不同来源的ChiVMV分离物在进化上可以聚为3个不同的分支,聚类结果具有明显的地理分布特征;遗传多样性和进化分析结果表明,各群体受到地理分布的影响而表现出较高的遗传多样性,各群体间的遗传分化显著且基因交流频率较低。研究结果为ChiVMV抗病品种的选育和该类病毒病的防治具有重要意义。

重庆地区烟叶辣椒脉斑驳病毒的检测与鉴定

为确定重庆烟区烟草叶片上出现黄化斑点、枯斑等症状的病原,进而制定出科学的综合防治措施,对采自重庆市涪陵和巫溪烟区与北碚试验田的18份烟叶样品进行了病毒种类检测与鉴定。根据病毒外壳蛋白基因序列设计了特异性引物,采用RT-PCR扩增及BLAST序列对比分析,结果表明:涪陵烟区烟叶上出现黄化斑点、枯斑等症状的样品中检测出烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV),检出率分别为54.55%和100%;巫溪烟区样品中检测出TMV和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY),检出率分别为100%和66.67%;北碚烟草试验田病叶样品中检测出ChiVMV,检出率为100%。其中,ChiVMV为重庆地区烟草上首次发现。

侵染广东辣椒的辣椒脉斑驳病毒的分子特征

辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是引起广东辣椒病毒病的主要病原之一,为了明确侵染为害广东辣椒的ChiVMV分子特征,采用分段RT-PCR和RACE扩增方法克隆了ChiVMV广东分离物(ChiVMV-GD)的基因组全序列,结果表明,除poly(A)尾外,ChiVMV-GD基因组大小为9 721 nt,编码一个大小350.44 kD多聚蛋白(位于167～9 436 nt),5′–非编码区(5′-UTR)和3′–非编码区(3′-UTR)分别含有166和285 nt,5′–末端结合病毒基因组连接蛋白(VPg),3′–末端含有poly(A)尾。序列同源性分析结果表明:Chi VMV-GD与Chi VMV其他分离物的基因组序列同源率为79.1%～96.9%,其中与来自中国海南分离物(登录号:GQ981316.1)的同源率最高(96.9%)。系统进化分析结果显示,ChiVMV-GD与海南分离物聚集在一个小分支,说明与海南分离物亲缘关系最近。

辣椒脉斑驳病毒病研究进展

辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)于1979年在马来半岛的辣椒上被首次报道,现已蔓延至世界各地。在中国,ChiVMV自2003年在陕西出现以来,已在四川、湖南、贵州等辣椒主产区大面积发生,成为严重危害辣椒生产的主要病害之一。本文中重点对ChiVMV危害症状、传播以及株系分化、基因组结构及功能、辣椒抗性鉴定、遗传以及分子标记定位等方面研究进行综述,以期为抗病育种工作提供理论参考。

辣椒脉斑驳病毒对烟草活性氧代谢和光合特性的影响

以普通烟为材料,研究了感染辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)后烟草叶片的生理活性以及光合特性的变化.结果表明ChiVMV侵染后宿主体内活性氧(超氧离子和H2O2)大量积累,而在CMV感染的植株中产生的活性氧较少.伴随活性氧的增加相关抗氧化物酶(SOD,CAT,POD)的活性也有升高.进一步测定叶绿素荧光参数发现,感病后烟草叶片的Fv/Fm、qP以及ETR等值明显降低,qN、NPQ值升高,并且ChiVMV对宿主光合参数的影响明显强于CMV.通过比较ChiVMV和CMV引起症状的差异性,发现ChiVMV的侵染使得植物产生大量的活性氧,造成了叶绿体结构的氧化性损伤,植物光合速率降低、叶绿体内淀粉粒积累减少,进而造成光合生物量的减少,植物生长受阻,导致感病植株的死亡.

辣椒脉斑驳病毒侵染性克隆构建的简易方法

本文介绍了一种构建辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)侵染性克隆的简易方法.基于辣椒脉斑驳病毒的全长确定序列,根据基因内部的单一限制性酶切位点,设计引物,将ChiVMV分成KL1,KL2,KL3三个片段通过RT-PCR和TA克隆的方法将3个片段构建到PMD19-T载体上.通过双酶切将ChiVMV前面7000bp的片段构建到载体上,从而将全部的ChiVMV cDNA分段构建到两个重组质粒中,成功地避免了全长病毒序列在大肠杆菌中不稳定的现象.进行体外转录时,先通过PCR扩增出两个彼此有一定重叠的平末端片段,再利用两个重叠片段为模板用重叠PCR的方法扩增出全长带T7启动子的ChiVMV cDNA,并通过T7RNA聚合酶成功转录出ChiVMV的病毒RNA.