GENE DIAGNOSIS OF HEMOGLOBINOPATHY IN CHINESE BY AMPLIFIED DNA

This paper describes the application of DNA amplification in vitro with the polymerase chain reaction on the prenatal diagnosis of thalassemia syndromes and on detection of HbS and HbD Punjab genes. DNA polymerase chain reaction was performed on lysed amniotic fluid cells or chorionic villus samples without prior DNA extraction and on DNA sampling from dried blood spots on filter paper blotters, α-thalassemia was prenatally diagnosed by direct analysis of amplified fetal target sequences on gel electrophoresis; and β-thalassemia was predicted by Hgi AI RFLP linkage analysis with amplified β-globin DNA. HbS and HbD Punjab genes were identified by Mst Ⅱor Eco RI mapping of the amplified β-globin DNA directly on the electrophoretic gels. The analysis of the amplified DNA does not require radioactive DNA probes and Southern hybridization. The total procedure can be completed within five hours.

天麻总DNA提取及聚合酶链反应扩增鉴定

目的:改良常用的植物DNA提取的CTAB,SDS法,以有效去除天麻多糖类杂质。方法:用CTAB法提取天麻鲜品不同部位(块茎、花序轴和胚芽)DNA;用生理盐水浸泡天麻干品之后,在应用CTAB,SDS法提取天麻干品的DNA;通过已知序列的天麻抗真菌蛋白基因片段的聚合酶链反应(PCR)扩增和PCR产物测序鉴定天麻DNA及其质量。结果:提取了44份天麻样本DNA,用CTAB法提取天麻鲜品不同部位的DNA,成功地用于PCR扩增,并通过DNA测序进一步鉴定;应用改良的CTAB,SDS法提取天麻干品DNA可用于PCR扩增,但DNA测序未成功。结论:用CTAB法提取的天麻鲜品各个部位DNA均可用于基因分析,而用天麻胚芽提取DNA的效果最理想;改良CTAB法能有效提取天麻干品DNA,提取的DNA可用于基因扩增。

用DNA扩增法检测镰状细胞基因

本文报道应用DNA扩增技术对国内首例镰状细胞特征患者(Hb s杂合子)进行基因诊断。方法是从患者干血标本中微量抽提基因组DNA,通过聚合酶链反应(PCR)扩增其β珠蛋白基因,经限制性内切酶MstⅡ消化后作电泳分析直接检测Hb S基因。本文介绍的DNA诊断技术快速、灵敏、简便,它不需要放射性同位素标记的探针,可以采用干血抽提的DNA,因此,对遗传病基因诊断和携带者的筛查具有重要价值。

TaqDNA聚合酶一步法获得TGF-β_1基因片段的RT-PCR扩增产物

以组织细胞中提取的总ＲＮＡ为模板，加入ＴａｑＤＮＡ聚合酶和一对以ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ为模板设计的引物，经变性、退火、延伸共３０次循环后，可以得到以ｃＤＮＡ为模板的扩增产物。实验证实ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有逆转录酶活性，用一步常规聚合酶链反应即可获取逆转录聚合酶链反应的ＴＧＦβ１４６８ｂｐ扩增产物。

基于水凝胶的基因组DNA固定法研究

目的:通过对人基因组DNA固定化的研究,探讨特异性高的单点共价固定方法,实现对人基因组DNA的反复利用。方法:选取Mirzabekov等发明的DNA-水凝胶共聚化学法作为基因组DNA固定方法,使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,以(CH2)6-NH2氨基末端修饰的PCR产物及甲酸随机断裂修饰的pGEM-T-HLA-G质粒为模板,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其固定效率,并通过PCR法检测该固定方法的热稳定性。将该法初步应用于人类基因组DNA的固定和反复利用,对基因组DNA扩增的片段进行测序,排除突变可能。结果:使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,实现了对质粒DNA以及人基因组DNA的固定和反复使用,该方法可以经受16轮的PCR扩增(每轮36个循环)。测序结果证实基因组DNA的扩增片段未发生突变。结论:甲基丙烯酰胺凝胶法固定DNA的热稳定性好,特异性高,可用于全基因组测序及SNP检测。

微滴数字聚合酶链反应法检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤DNA表皮生长因子受体基因突变的临床价值研究

目的探讨微滴数字聚合酶链反应法(ddPCR)检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤脱氧核糖核酸(ctDNA)中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的临床价值。方法收集2015年5月至2017年4月在北京胸科医院确诊的初治晚期肺腺癌患者共136例,突变扩增系统(ARMS)检测肺癌肿瘤组织中EGFR基因突变情况;ddPCR和ARMS技术检测血浆中EGFR的基因突变情况。EGFR敏感突变患者均接受比较不同检测技术的符合率,EGFR敏感突变患者一线接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)口服治疗。通过生存分析比较不同技术检测EGFR基因突变患者无进展生存时间(PFS)。结果136例肺癌肿瘤组织样本中,共检测到111例EGFR敏感突变(81.6%),其中含Exon21 L858R突变48例(43.2%),含Exonl9 del突变59例(53.2%),其他突变4例(3.6%)。ARMS检测血浆EGFR基因突变的敏感度为58.6%,特异度为96.0%。ddPCR检测血浆EGFR突变的敏感度为79.3%,特异度为100%,与肿瘤组织检测的符合率达83.1%(Kappa=0.685,P<0.001).Kaplan-Meier生存分析显示,在组织检测EGFR基因突变的亚组分析中,与单一技术检测阳性的病例相比,ddPCR和ARMS两种技术均为阳性的患者无进展生存时间最短(11.6个月比14.8个月,Х^2=2.517,P=0.026).结论作为一种可靠的、高敏感度和特异度的技术,ddPCR有望应用于检测血浆ctDNA EGFR基因突变情况.血液检测EGFR基因突变可预测患者对EGFR-TKI的疗效.

抗-HBs阳性者血清乙型肝炎病毒DNA检测的价值

有研究表明抗-HBs的出现并不标志乙型肝炎病毒(HBV)复制的停止.套式聚合酶链反应(PCR)既能保持常规PCR的特异性又能提高检测灵敏度,因而受到关注.

银染mRNA差异显示方法的建立

目的 建立银染 m RNA差异显示方法 ,为差异表达基因片断的分离克隆奠定基础。 方法 采用随机引物和锚定引物各 1条 ,建立差异显示反转录聚合酶链式反应 (DDRT- PCR)和银染方法 ,对 DDRT- PCR过程中各实验影响因素进行优化 ,割取差异条带进行二次扩增。 结果 当总 RNA用量为 0 .2μg,引物浓度为 0 .6～ 1.0μm ol/ L ,d NTP浓度为 2 0 0μmol/ L ,Mg Cl2 浓度为 1.6～ 2 .0 mm ol/ L时 ,同时起始 5个循环的退火温度为 5 0℃ ,扩增效率最佳 ,特异性好 ,背景干净。 结论 DDRT- PCR方法简便、快捷、灵敏、高效 ,可用于分离差异表达基因。

采用十二烷基硫酸钠抑制PCR产物中残留尿苷酶

目的 :研究抑制PCR产物中残留尿苷酶 (uracilDNAglycosylase ,UDG)活性的试剂。 方法 :采用DNA EIA技术检测在全dU DNA扩增物中含有稳定剂和不含稳定剂的样品 ,置室温 2 4h和 37℃ 4 8h的DNA杂交百分率。结果 :(1)在PCR产物中加入稳定剂A液和B液置室温 2 4h ,取 5 μl直接杂交 ,其杂交百分率为 6 1.4 70 %和6 8.996 % ,对照组为 99.2 83%。 (2 )在 30 μlPCR产物中加入稳定剂后 ,并加 1×PCR缓冲液稀释至 70 μl,置 37℃4 8h取 10 μl样品杂交 ,5 μl和 2 .5 μlA液组杂交百分率为 71.0 92 %和 6 7.6 91% ,对照组为 6 8.0 2 0 %和 6 3.90 6 %。5 μl和 2 .5 μlB液组杂交百分率为 91.333%和 80 .30 7% ,对照组为 6 3.90 6 %和 6 8.0 2 0 %。 结论 :B液可抑制PCR产物残留UDG活性 ,对保护全dU

脊髓性肌萎缩症单细胞巢式聚合酶链反应技术的建立及初步应用

目的建立单细胞巢式聚合酶链反应技术,并探讨进行脊髓性肌萎缩症基因诊断的可行性,为植入前遗传学诊断奠定基础。方法应用显微操作技术从外周血中分离单个淋巴细胞,制备单细胞DNA模板。分别应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方法扩增正常对照者外周血中单个淋巴细胞运动神经元生存(SMN)基因第7、8号外显子,计算其阳性率,建立SMN1基因的单细胞巢式聚合酶链反应技术。并应用该项技术及限制性酶切对1例脊髓性肌萎缩症患者进行基因诊断。结果正常对照者巢式聚合酶链反应共扩增60个外周血单个淋巴细胞SMN1基因第7号外显子,其中54个扩增成功,阳性率为90%;引物延伸预扩增共扩增10个外周血单个淋巴细胞,巢式聚合酶链反应分别扩增SMN1基因第7、8号外显子,在20个聚合酶链反应扩增中共有17个单个淋巴细胞扩增成功,阳性率为85%。应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方法对1例脊髓性肌萎缩症患者单个淋巴细胞扩增后经限制性酶切显示SMN1基因缺失,结果与全血基因组聚合酶链反应-限制性酶切一致。结论巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增方法各有优缺点,巢式聚合酶链反应耗时短、操作简便,可作为脊髓性肌萎缩症患者单细胞基因诊断的首选方法。

急性髓系白血病中医证型与ID4基因启动子区甲基化相关性研究

目的研究急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者骨髓细胞中ID4基因启动子区甲基化状态与中医证型的关系,探讨ID4基因甲基化与AML发生、发展的关系。方法选取35例2010年2-12月山东中医药大学附属医院血液科住院或门诊AML患者作为试验组,另选取10名山东中医药大学附属医院健康体检中心体检健康者作为对照组,采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerasechain reaction,MS-PCR)检测两组ID4基因启动子区甲基化状态并进行组间及中医证型间比较,分析中医证型与基因启动子区甲基化相关性。结果 AML患者ID4基因启动子区甲基化为27例(77.1%),与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。各证型患者ID4基因启动子区甲基化阳性率由低到高依次为气阴两虚证<瘀血痰结证<毒热炽盛证,差异均有统计学意义(P<0.05)。ID4基因启动子区甲基化阳性患者外周血白细胞数、骨髓原始细胞比例高于阴性患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论毒热炽盛证、瘀血痰结证患者更易出现ID4基因甲基化,ID4基因启动子区甲基化阳性表达从分子水平验证了AML初期中医邪实内存的本质,也一定程度上反映了AML恶性程度。

基因组简并寡核苷酸引物聚合酶链反应的影响因素

目的:对影响现有微量基因组扩增方法———简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR)的因素进行探讨。方法:针对现有DOP-PCR扩增过程中存在的影响产物产量和特异性的因素进行分析,分别从不同的DNA模板来源、模板梯度稀释与否以及DOP-PCR扩增产物是否采用低熔点胶回收去除干扰分析的小片段等方面进行研究,最后以特异性基因(FTCD和CBS)PCR扩增的结果作为评价指标,了解上述因素对DOP-PCR扩增的影响。结果:以小鼠单个卵细胞基因组为模板与以肝基因组DNA为模板相比,在产量上前者明显低于后者,特异性上两者相当。小鼠肝基因组DNA梯度稀释作为模板进行扩增的结果没有明显差异。与未经低熔点胶回收的DOP-PCR产物相比,经低熔点胶回收的DOP-PCR产物在常规PCR扩增反应中得到的产物特异性更好。结论:应用DOP-PCR方法进行扩增时,小鼠单个卵细胞可以用来进行DOP-PCR的扩增从而用于对特异性基因的检测,但是在扩增产量方面需要进一步的改进或优化。对现有DOP-PCR反应进行产物低熔点胶回收纯化,能够增加产物的特异性,效果满意。

某市2109例女性宫颈细胞中HPV基因型别的研究

目的人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要致病原因。本文旨在探讨深圳市女性宫颈细胞中23种HPV感染的基因型分布情况。方法从深圳市妇幼保健院体检中心的2109例女性宫颈上皮细胞标本中提取23种HPVDNA,采用基因扩增及基因芯片技术对其宫颈细胞中的23种HPV基因型别进行检测,并对受检者的感染情况进行分析。结果 2109例女性宫颈上皮细胞标本中检出HPV感染者446例,总的HPV感染率为21.15%(446/2109),其中单一型别的阳性检出率为15.32%(323/2109);单一型别的感染中HPV52型为47例,其阳性检出率为2.23%(47/2109),其次是HPV43和58型均为38例,其阳性检出率均为1.80%(38/2109),是单一型别感染中最主要的型别。混合型HPV感染123例,其阳性检出率为5.83%(123/2109);其中HPV16+43、HPV16+58型各5例,均占混合型感染的4.07%(5/123),其次是HPV43+52、HPV43+56、HPV43+66型的二重感染各3例,均占混合型感染的2.44%(3/123),是混合型感染的主要型别。结论 HPV43、HPV52、HPV58单一型别及HPV16+43和HPV16+58型是感染深圳市女性宫颈细胞的主要基因型别,基因芯片检测技术可应用于宫颈细胞标本,一次可检测23种HPV基因型别,特异性强,敏感性高,对中国女性宫颈HPV感染基因型的分子流行病学的调查研究具有重要的意义。

微滴数字聚合酶链反应法检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤DNA表皮生长因子受体基因突变的临床价值研究

目的 探讨微滴数字聚合酶链反应法（ddPCR）检测晚期肺腺癌患者血浆循环肿瘤脱氧核糖核酸（ctDNA）中表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的临床价值.方法 收集2015年5月至2017年4月在北京胸科医院确诊的初治晚期肺腺癌患者共136例,突变扩增系统（ARMS）检测肺癌肿瘤组织中EGFR基因突变情况;ddPCR和ARMS技术检测血浆中EGFR的基因突变情况.EGFR敏感突变患者均接受比较不同检测技术的符合率.EGFR敏感突变患者一线接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）口服治疗.通过生存分析比较不同技术检测EGFR基因突变患者无进展生存时间（PFS）.结果 136例肺癌肿瘤组织样本中,共检测到111例EGFR敏感突变（81.6％）,其中含Exon21 L858R突变48例（43.2％）,含Exon19 del突变59例（53.2％）,其他突变4例（3.6％）.ARMS检测血浆EGFR基因突变的敏感度为58.6％,特异度为96.0％.ddPCR检测血浆EGFR突变的敏感度为79.3％,特异度为100％,与肿瘤组织检测的符合率达83.1％（Kappa=0.685,P〈0.001）.Kaplan-Meier生存分析显示,在组织检测EGFR基因突变的亚组分析中,与单一技术检测阳性的病例相比,ddPCR和ARMS两种技术均为阳性的患者无进展生存时间最短（11.6个月比14.8个月,χ^2=2.517,P=0.026）.结论 作为一种可靠的、高敏感度和特异度的技术,ddPCR有望应用于检测血浆ctDNA EGFR基因突变情况,血液检测EGFR基因突变可预测患者对EGFR-TKI的疗效.

地鳖的环介导等温扩增快速鉴别

目的:建立基于环介导等温扩增技术(LAMP)的地鳖分子鉴定方法。方法:针对地鳖COⅠ序列设计特异性引物2对(外引物DB-F3、DB-B3和内引物DB-FIP、DB-BIP),在含有Bst DNA聚合酶和甲基红-苯酚红指示剂的反应体系下于63℃下恒温扩增90 min,通过目测检视判断反应结果,与DNA条形码和聚合酶链式反应(PCR)鉴定方法进行对比,考察方法专属性和灵敏度。结果:11批地鳖样品均由紫红色变为橙黄色,1批冀地鳖、9批金边土鳖和1批伪品龙虱均为紫红色,鉴别结果与DNA条形码,PCR结果一致,LAMP检出限为0.984 ng·mL^(-1)。结论:本项目建立的LAMP检测方法准确,灵敏度高,操作简便快捷,对设备要求低,可应用于地鳖鉴别的快速筛查。

PCR-RDB技术快速检测儿童急性呼吸道感染DNA病毒的研究

目的建立多重PCR反向斑点杂交方法（PCR-RDB）技术快速检测儿童急性呼吸道感染DNA病毒，以便及时监测并快速诊断急性病毒性呼吸道感染。方法参照国家生物技术信息中心（NCBI）数据库病毒核酸序列设计多重PCR引物和探针，将特异的寡核苷酸探针固定于尼龙膜上。利用多重PCR对人博卡病毒（hBOV）、KI多瘤病毒（KI）、腺病毒（AdV）、WU多瘤病毒（WUPyV）、人细小病毒B19（HPVB19）等5种DNA病毒进行扩增，扩增产物变性后与各特异性探针进行杂交、显色并分析结果，并对其敏感性、特异性进行测试。同时通过反向斑点杂交检测108例临床标本的多重PCR产物，并与培养法结果做对比分析。结果建立的多重PCR—RDB方法各特异探针只相应扩增产物杂交，与其他病原体无交叉反应，敏感性达1 CFU。108例临床咽拭子标本PCR—RDB方法共筛选出阳性37例（34．26％），高于临床常规检测方法的30例（27．78％）。结论应用多重PCR-RDB技术可简便、快速、准确地检测儿童急性呼吸道感染DNA病毒，具有很好的临床应用前景。

五种乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒的比较

目的比较5种国内外HBV DNA定量检测试剂盒的灵敏度、特异度和符合率。方法分别应用A、B、C、D4种国产和德国Roche公司生产的荧光定量试剂盒检测国家HBVDNA标准品、7份灵敏度稀释血浆（15．6～1000IU／mL）、15份健康献血者和45份慢性乙型肝炎患者血浆。统计学分析采用平行性检验。结果5种试剂盒对9份阳性和8份阴性国家标准品均能正确检出，并能准确定量标准品中的灵敏度样本；对灵敏度稀释血浆，Roche试剂盒和国产试剂盒C、D均能检出最高稀释度样本（15．6IU／mL），而试剂盒A和B检测限分别为125IU／mL和500IU/mL，Roche试剂盒及C试剂盒的定量检测结果与理论值的符合率高，两者检测结果经平行性检验存在线性相关（r〉0．98）；检测15份健康献血者血浆，试剂盒D有2份假阳性；检测慢性乙型肝炎患者血浆，Roche试剂盒对1×10^2～1×10^2IU／mL范围的样本检测的变异系数均〈15％，而国产试剂盒变异系数较大。4种国产试剂盒与Roche试剂盒的符合率为50％～96％，其中A为61％，B为50％，C为96％，D为83％，试剂盒C符合率显著高于试剂盒D、A和B（χ^2=5．62，P〈0．05；χ^2=28．93，P〈0．01；χ^2=44．31，P〈0．01）。各种试剂盒符合率最高的区段均在1×10^4～1×10^8IU／mL。结论国产HBVDNA定量试剂盒质量差异较大，试剂盒C与Roche试剂盒定量检测HBVDNA的符合率最高，国产试剂盒质量有待进一步提高。

多重PCR方法同时鉴别人参、西洋参、三七

目的:建立一种能同时鉴别人参属人参、西洋参、三七3种药材的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法:通过分析人参、西洋参、三七psb A-trn H基因序列的差异设计了特异性引物对1,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)分子标记技术筛选获得的特异性片段的基因序列,设计了特异性引物对2;优化了多重PCR鉴别体系并验证其耐受性和实用性。结果:构建的多重PCR鉴别体系能够成功地鉴别人参、西洋参、三七,人参样本可扩增出片段大小约为150 bp的特异性条带,西洋参样本可扩增片段大小出约为150 bp和400bp 2条特异性片段,三七样本可扩增出片段大小约为400 bp的特异性条带。结论:本多重PCR鉴别体系特异性好,可准确、可靠地鉴别人参、西洋参、三七。