Evaluation of transfection methods for transient gene expression in Chinese hamster ovary cells

Three transfection reagents, Lipofectamine&reg 2000, TransIT-PRO&reg and linear 25 kDa polyethylenimine were evaluated for transient expression of enhanced green fluorescent protein in Chinese hamster ovary cells. TransIT-PRO&reg was found to be more efficient under the examined conditions, but comes at an increased cost compared to the widely used PEI.

高效治疗性抗体CHO细胞株的构建方法及其评价

目的采用一种高效的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞株构建方法获得稳定高表达治疗性重组蛋白的CHO细胞株。方法利用自主研发载体构建含目的基因的真核表达质粒,经电击转染转入CHO细胞中,经抗性压力筛选后使用细胞池至单克隆的一步筛选策略,配合一种新型的细胞成像系统,高效、快速地筛选出高表达单克隆株。结果成功构建多株稳定的高表达单克隆细胞株,其产量最高可至5.2 g·L^(-1);实验通过毛细管等电聚焦电泳法等进一步验证了细胞株产物关键质量特性,等电点均为9.2,所得抗体等电点较好。结论相比传统的构建方法需6~8个月,本研究筛选得到的高表达单克隆细胞株周期缩短了2个月。

CHO/dhfr^-细胞定点整合高效表达系统的建立

为了克服随机整合建立高表达细胞株时“位置效应”所带来的不可预知的后果,我们尝试建立基于定点整合的CHO高效表达系统。首先设计一个新的高效筛选载体pMCEscan。该载体含有报告基因(k2tPA)、扩增基因(dhfr)、重组酶识别序列(FRT)及筛选基因(neo),且neo基因的表达经过系统的弱化,确保能够对基因组中的整合位点进行大规模的高效筛选。然后利用该载体转染CHO/dhfr-细胞并进行大规模筛选以获得足够多的阳性克隆,并对阳性克隆进行系统分析,筛选出报告基因表达水平高、单拷贝且扩增效果好的克隆,此克隆被认为筛选载体整合入CHO细胞基因组中转录热点(Hotspot)区域,从而获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/dhfr-细胞系。随后利用位点特异性重组系统(FLP-FRT)将外源基因定点整合到Hotspot区域,以实现外源基因在CHO细胞基因组中的定点整合及高效表达。并利用该细胞系实现了k2tPA的高表达,表达量达到17.1μg/106cell.24h。该研究致力于CHO细胞基因组中高表达位点的寻找和确认,建立基于定点整合的哺乳动物细胞高效表达系统。

转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用

[目的]探讨转基因下游MAR在稳定转化的CHO细胞中对基因表达的调控作用。[方法]将PCR扩增得到的人β-珠蛋白MAR插入到真核表达载体pCATG的下游,构建转基因表达盒3′端含MAR的表达载体。酶切鉴定正确后,转染CHO细胞,G418筛选出稳定转化的细胞株,ELISA分析转基因的表达水平,半定量PCR分析转基因相对拷贝数。[结果]结果表明,表达盒3′端含MAR序列能使转基因表达水平降低,其基因拷贝数则有一定程度的增加。转基因下游β-珠蛋白MAR在一定程度上能抑制外源基因的表达水平;外源基因表达量与基因拷贝数不成正比,未呈现出"拷贝数依赖性"。[结论]该研究结果为进一步研究MAR的调控机制奠定基础。

PcDNA4/His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的构建PcDNA4/HisC-MBL表达载体,在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)。方法应用PCR从含有中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段,将其克隆至PcDNA4/HisC真核表达载体。经酶切及测序鉴定后,以电穿孔法转染CHO细胞,以RT-PCR分析其mRNA表达,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性。结果从pGEM-MBL中扩增得到约750bp的cDNA片段,构建成重组载体经酶切出现约5100和750bp片段,测序鉴定与预期的完全一致。RT-PCR证实转染细胞有MBLmRNA表达,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58000和87000条带,其中29000蛋白带可与6-His抗体反应。纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1∶819200,与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1∶25600。结论获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL,为MBL分子的进一步研究提供了条件。

重组血小板糖蛋白Ibα活性片段在CHO细胞中表达及其功能研究

目的:建立表达重组糖蛋白Ibα活性片段(rGPIbαH1-V289)细胞株,并且纯化其表达产物,研究其生物学功能。方法:利用脂质体将含有编码GPIbαH1-V289的DNA质粒pCMV3转染CHO细胞。用亲和层析法纯化重组片段。用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产品的纯度和免疫学活性。用血小板聚集法检测纯化产品对瑞斯托霉素诱导血小板聚集功能的影响。用ELISA测定纯化产品对vWF与血小板结合能力的影响。结果:每1L培养上清液可纯化到6.15mgrGPIbαH1-V289重组产品。SDS-PAGE显示,纯化的重组片段主要在42kD处显一蛋白区带,Western blot显示,抗GPIbα单抗SZ-2能与重组片段在42kD处显单一蛋白区带。纯化重组片段能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能。ELISA测定显示纯化产品抑制血浆vWF与血小板的结合能力。结论:CHO细胞株A1能恒定表达rGPIbαH1-V289,重组片段具有较高的纯度、免疫学活性和生物学活性,有可能开发为有效的抗血栓药物。

Epstein─Barr病毒膜抗原在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达

将切去３’端穿膜序列的ＥＢ病毒膜抗原（ＭＡ）基因，插入ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ质粒的ＳＶ４０早期启动子下游，构建了真核表达载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒＧＰＴＲ，使两个ＳＶ４０早期启动子分别调控ＭＡ和二氢叶酸还原酶（ｄｈｆｒ）基因。将该重组质粒转化ＣＨＯ－ｄｈｆｒ细胞，在选择培养基中筛选阳性克隆，用氨甲喋呤加压扩增，建立了表达ＥＢＶ－ＭＡ的克隆细胞系。ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，所表达的蛋白的分子量大约为３４０ｋｄ和２２０ｋｄ。经过细Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ２Ｂ琼脂糖凝胶层析初步纯化的抗原与福氏佐剂混合免疫小鼠，２周后小鼠血清中出现明显的ｇｐ３４０／２２０特异性抗体，表明切去嵌膜区结构的ＥＢＶ－ＭＡ基因在ＣＨＯ细胞中的表达产物具有同天然膜抗原相似的分子量大小、糖基化程度、免疫特异性和免疫原性，可望成为ＥＢ病毒人用基因工程亚单位疫苗。

Bcl-2蛋白对环匹阿尼酸诱导CHO细胞凋亡的保护作用

Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色和ＤＮＡ电泳分析揭示了内质网钙泵抑制剂环匹阿尼酸（ＣＰＡ）呈浓度依赖性地诱导ＣＨＯ细胞凋亡，表现出染色体固缩和ＤＮＡ片断形成的典型特征．Ｂｃｌ－２的过度表达对ＣＰＡ诱导的ＣＨＯ细胞凋亡具有保护作用．采用Ｆｕｒａ－２技术测定细胞内游离钙浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）变化，观察到Ｂｃｌ－２对ＣＰＡ触发的细胞Ｃａ２＋库Ｃａ２＋释放无任何影响．结果表明Ｂｃｌ－２蛋白对ＣＰＡ诱导的ＣＨＯ细胞凋亡的保护作用不是通过抑制ＣＰＡ诱导的Ｃａ２＋释放。

表达IFNα2b-HSA融合蛋白的CHO细胞培养基优化及发酵放大

毕赤酵母表达的干扰素与白蛋白融合蛋白虽然避开了干扰素单体半衰期短的缺陷,但毕赤酵母对药物的糖基化修饰与人体的糖基化修饰差异性导致了药物的毒副作用。目前药物在CHO系统的表达得到了广泛应用。本研究室首次构建了能表达干扰素α2b和人血清白蛋白融合蛋白（IFNα2b-HSA）的CHO细胞株。在此基础上,本研究通过对12种国产商业化基础无血清培养基和5种流加培养基进行优化筛选,获得最适培养方案：基础培养基选择最适于生长的5号培养基（M2∶M4=1∶1）,流加培养基选择最有适于表达的F4培养基。在此基础上,进行5L生物反应器的发酵放大,pH为6.9-7.4,DO为40%-60%,细胞密度达到7.0×106cells/mL时,温度由37℃降温至34℃,细胞活率降至80%时停止发酵,最终融合蛋白表达量达到137mg/L。初步实现了IFNα2b-HSA融合蛋白在CHO细胞中的高密度发酵。

转染VMAT_2基因的CHO细胞抵抗多巴胺毒性作用的研究

目的：探讨囊泡单胺转运体（vesicular monamine transporter-2，VMAT2）对多巴胺（dopamine，DA）毒性的抵抗作用。方法：采用细胞免疫荧光染色法测定VMAT2基因在转染的CHO细胞（VMAT2-CHO）中的表达：MTF比色法检测不同浓度DA作用下的野生型CHO（WT-CHO）和VMAT2-CHO细胞存活率；应用ELISA法DA检测试剂盒测定细胞内DA的水平；采用活性氧检测试剂盒测定细胞内活性氧的水平。结果：VMAT2-CHO细胞内有较强的特异性荧光表达，主要定位在核周区域，胞浆中也有散在的荧光；0．25～0．4mmol／L DA作用72h，VMAT2-CHO细胞存活率显著高于WT-CHO细胞（P〈0．05）；0．4mmol／L DA作用于WT-CHO和VMAT2-CHO细胞24h，VMAT2-CHO细胞内DA为（199．33±15．155）ng／mi，显著高于WT-CHO细胞（141．4±8．784）ng／ml（P〈0．01）；而细胞内活性氧（ROS）水平则由（144．490±5．295）U／106 cells增加至WT-CHO细胞的（217．895±15．885）U／10^6cells（P〈0．01）。结论：转染VMAT2的CHO细胞对DA引起的毒性有显著的抵抗作用。

中华仓鼠卵巢(CHO)工程细胞无血清培养的研究

以DMEM∶F12(1∶1)为基础培养基,通过观察细胞生长状态和检测乙肝表面抗原的表达量作为评价指标,筛选适合于CHO工程细胞生长的生长因子,如胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、硒酸钠,丁二胺等。并且建立了J5SFM培养基。该培养基与商品化的无血清培养基比较,能够使细胞生长维持较长的时间,表达产物分泌量也相对较高。

利用同源蛋白的信号肽和前肽序列在CHO细胞中表达重组人BMP6

BMP6属于TGF-β超家族,具有较强的骨诱导作用。主要利用BMP6自身的信号肽、前肽与成熟肽基因序列构建了表达质粒pcDNA-BMP6;同时利用BMP2的信号肽、前肽与BMP6的成熟肽基因序列构建了表达质粒pcDNA-BMP2/6。将两种质粒分别瞬时转染Cos7细胞,发现质粒pcDNA-BMP2/6表达rhBMP6的效率高于质粒pcDNA-BMP6。然后将质粒pcDNA-BMP2/6与含二氢叶酸还原酶基因(dhfr)的表达质粒共转染dhfr缺陷型的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞,经G418筛选、氨甲蝶呤(MTX)介导目的基因扩增、亚克隆后得到表达rhBMP6成熟肽的单克隆细胞株。将表达产物rhBMP6初步纯化后,能诱导前成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向转化,显示其具有骨诱导作用。

克服位置效应提高外源基因在CHO细胞中稳定高效表达的策略

能够生产有功用的治疗性蛋白的一个重要前提是获得稳定的重组蛋白高表达细胞株,然而筛选一个能够持续稳定表达外源蛋白的重组细胞株是费时费力的过程。有多篇文献报道了重组蛋白细胞株表达的不稳定性。位置效应是高表达细胞株不稳定性的重要因素,克服或利用位置效应是当前获得稳定高表达重组蛋白细胞株的有效途径。为解决外源基因插入的随机性所带来的不可预知的后果,可以事先在CHO细胞基因组中筛选转录热点区域,再通过位点特异性或同源重组的方式,实现外源基因的定点整合。各种调节位置效应的DNA元件陆续被发现,可以利用它们去调控基因表达及增加细胞株的稳定性。

用转染m2胆碱受体基因的CHO细胞观察知母皂甙元的作用

目的观察知母甾体皂甙元 (sarsasapogenin ,SAR)对M2 受体亚型的调节作用。 方法采用转染了m2胆碱受体基因的CHO细胞为模型 ,以非选择性的3H -QNB作单点放射配基结合分析。 结果CHOm2细胞受体密度在培养 48h达顶峰 ,以后呈进行性下降。SAR对下降的CHOm2细胞M2 受体密度有明显的上调作用 ,这一作用有一定浓度依赖性。 结论SAR对下降的M2 受体密度具有上调作用。

用CHO细胞进行SCE检验方法探索

以姐妹染色单体交换 (sisterchromatidexchange ,SCE)为指标 ,是继微核检测之后对各种化学物质的遗传毒性做进一步研究的有效方法。通过对化学物质进行SCE的数据统计 ,可以在一定程度上反映其致突变作用 ,是遗传毒性的敏感指标。试验中 ,应用CHO细胞株为主要材料 ,建立了以体外培养细胞SCE试验方法。在CHO细胞SCE试验中 ,在正式制片处理前 3～ 4h加入秋水仙素 ;细胞通过 6 5～ 70min低渗 ;第 3次固定甲醇 -冰乙酸比例为 1∶2 ;在加入 5 -溴脱氧尿嘧啶 (BUdR)后 1～ 1.5个细胞周期后对细胞进行收获能取到最佳制片效果 。

人谷胱甘肽硫转移酶M1基因在CHO细胞中的表达

目的 构建人谷胱甘肽硫转移酶M1(GSTM1)的CHO细胞表达体系。方法 重组质粒pcDNA3 1 GSTM1用LipofectamineTM2 0 0 0转染CHO细胞 ,用G418筛选细胞的阳性克隆 ,并用PCR、RT PCR和Westernblot进行鉴定 ,测定GSTM1酶活性。结果 GSTM1基因已转染到CHO细胞的基因组 ,并转录表达 ,生成GSTM1蛋白 ,经测定活性达到2 8mmol/ (min·mgprot)。结论 通过CHO GSTM1细胞表达 ,为基因工程生产具有完整功能GSTM1的进一步纯化提供了材料 ,为研究化学致癌物在真核细胞中的代谢 ,作为遗传药理学、毒理学研究的候选细胞株奠定了基础。

牛血清在百日咳毒素CHO细胞簇聚试验中的影响

目的观察不同胎牛血清对百日咳毒素在中华仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell,CHO）细胞簇聚试验中的影响。方法分别用两个厂家共6批次的牛血清培养CHO细胞,连续传3代后进行细胞簇聚试验,观察添加PT阳性对照、纯化PT、脱毒PT后其细胞的簇聚效果。结果 1、2号牛血清培养的CHO细胞生长缓慢,3-6号牛血清培养的CHO细胞生长正常。质量浓度16 ng/m L的PT阳性对照和纯化PT均未引起1-2号CHO细胞簇聚;3-6号牛血清培养的CHO细胞PT阳性对照判定终点分别为2、1、16、4 ng/m L,其纯化PT判定终点分别为1、0.5、8、2 ng/m L;脱毒PT质量浓度为40μg/m L时,1、2、5号牛血清培养的CHO不簇聚,而3、4、6号牛血清培养的CHO细胞脱毒PT判定终点分别为10、5、20μg/m L。结论 6种牛血清培养的CHO细胞簇聚程度存在差异,其中以4号牛血清培养的CHO细胞对PT阳性对照、纯化PT和脱毒PT最为敏感。需筛选对簇聚试验敏感度高的牛血清用于百日咳毒素CHO细胞簇集试验。

t－PA cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）的细胞株。将ｔ－ｐＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。结果：培养液中重组ｔ－ｐＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔ－ｐＡ，ｒｔ－ｐＡ）活性＞６０００ＩＵ／１０６细胞ｄ－１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的转录。高表达细胞连续传代１０次后，培液中ｒｔ－ｐＡ活性未见明显变化。结论：转染ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的ＣＨＯ细胞已形成稳定的工程细胞。

人白细胞介素-2在CHO细胞中的表达及其纯化

将IL-2cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因插入质粒pSVL,组建了pSVLD/IL-2,转化CHOdhfr^-细胞,在选择培养基中筛选出表达阳性的细胞克隆,为了提高表达量,在DMEM培养基中逐渐增加氨甲喋呤(MTX)的浓度,使已整合的IL-2基因同DHFR基因一同扩增,最后得到了能耐受50μmol/L MTX的4个细胞株,表达活性大于5.1×10~5U/L,转化的细胞株传30代仍能稳定地分泌IL-2。同时,对CHO细胞分泌的糖基化IL-2进行了初步的纯化研究,将含有IL-2的细胞培养液用硫酸铵沉淀浓缩后,再经分子筛柱(Sepharose 4B)、离子交换柱(DEAE-SepharoseCL 6B)以及反向柱ProRPC3步纯化后,总回收率大于40％,比活性达9.6×10~6U/mg。

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的:构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中呈分泌型表达,为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。方法:采用多聚酶链反应(PCR)技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA(cDNA)的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中,获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG;采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株;免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。结果:DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点,CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达,其分子量大小和预期的基本一致,该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。结论:成功构建pcDNA/CD80-IgG真核表达载体,并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。