中华绒螯蟹Eriocheir sinensis两个地理种群的微卫星DNA多态性分析

为了获取中华绒螯蟹群体遗传多态性的基本数据,寻找合适的遗传标记区分不同种类及不同水系的河蟹种群,采用微卫星DNA分型技术,对江苏地区两个地理种群(本地种与荷兰种)的中华绒螯蟹共计140个样本,通过DNA提取、PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测的方法,进行了两个微卫星基因座(Esin 67和Esin 87)的遗传多态性分析.结果表明:中华绒螯蟹本地种与荷兰种的两个微卫星基因座均有较好的多态性;在Esin 67基因座中,本地种和荷兰种绒螯蟹均有8个等位基因,两组的最高频率等位基因均为8重复序列;在Esin 87基因座中,本地种绒螯蟹有9个等位基因,荷兰种有7个等位基因,两组的最高频率等位基因均为9重复序列.同时中华绒螯蟹荷兰种这两个基因座的杂合度和多态性信息含量均高于本地种.这些结果提示了江苏本地的绒螯蟹可能受到其它地区河蟹的种质污染,基因多态性下降,因此需要加强对种质资源遗传变异的深入研究,以便采取措施对河蟹资源进行合理的管理、保护和开发利用.

用小卫星探针33.6对中华绒螯蟹遗传多态性的DNA指纹图谱研究

运用DIG标记的人源小卫星探针 33 6与用HaeⅢ消化的中华绒螯蟹 (Eriocheirsinensis)基因组DNA杂交 ,进行了中华绒螯蟹种群遗传多态性的非放射性DNA指纹图谱研究。实验表明 :用人源小卫星探针 33 6在中华绒螯蟹DNA指纹图谱中可检测到 1 0个以上位点的遗传变异 ,这些位点均表现丰富的多态性 ;人源小卫星探针 33 6产生的中华绒螯蟹DNA指纹图谱具有个体特异性 ,但未表现出中华绒螯蟹种或种群特异的分子遗传标记 ,长江蟹、辽河蟹与人工繁育长江蟹的群体内相似指数分别为 0 2 92、 0 375和0 30 6;长江蟹与辽河蟹、长江蟹与人工繁育长江蟹、辽河蟹与人工繁育长江蟹群体间相似指数分别为 0 1 78、0 2 66和 0 1 79。

长江、辽河、瓯江三水系中华绒螯蟹mt12SrDNA片断序列的比较

本实验根据马蹄铁鲎mtDNA 12SrRNA基因序列进行了中华绒螯蟹mtDNA 12SrRNA基因的引物设计,并对长江、辽河、瓯江三水系各5个个体共15个个体进行了PCR扩增及其序列测定。结果表明,12SrRNA基因序列在长江种群、辽河种群、瓯江种群间几乎没有差异,仅在3号瓯江蟹415bp处发现有一碱基颠换,去掉两端引物共测定得到415bp的碱基序列、其中A、T、G、C含量分别为145bp(34.9%),165bp(39.8%),45bp(10.8%)和60bp(14.5%)。

不同提取方法和不同组织对中华绒螯蟹DNA提取效果的比较研究

为了优化中华绒螯蟹基因组DNA提取方法,采用酚-氯仿法和试剂盒法分别对中华绒螯蟹的鳃、肌肉、血淋巴液和刚毛4种组织进行DNA提取,并从纯度、浓度、片段完整性及微卫星标记PCR扩增效果4个方面评价提取DNA的质量。结果显示:酚-氯仿法提取的DNA片段比试剂盒法提取的更完整,且DNA浓度较高,但纯度稍低;无论何种提取方法,刚毛和血淋巴液中的DNA纯度都高于鳃和肌肉,4种组织中的DNA含量依次为鳃>肌肉>刚毛>血淋巴液,未剪碎刚毛中未能提取到基因组DNA;微卫星标记的电泳结果表明,两种提取方法下4种组织中提取的DNA均可满足微卫星标记的应用要求。综上,本研究建立了一种简便的非损伤性中华绒螯蟹的采样及其DNA提取方法,这对于进行中华绒螯蟹遗传育种和分子标记研究等方面具有一定的积极作用。

显微介导河蟹总DNA导入镜鲤的检测与分析

利用显微介导远缘杂交技术将河蟹总DNA直接导入镜鲤受精卵内,再利用AFLP分子标记技术检测显微介导河蟹基因镜鲤的外源DNA。在30对AFLP引物中,有3对引物扩增出供体基因片段,即在显微介导河蟹基因镜鲤中均有和河蟹基因相同而对照镜鲤没有的条带。对6尾阳性显微介导河蟹基因镜鲤的扩增产物进行回收、克隆和测序验证。结果表明:阳性显微介导河蟹基因在镜鲤中均含有供体基因目的片段。本研究在分子和基因水平上验证了河蟹总DNA可通过显微介导方式整合到镜鲤基因组中,为显微介导外源总DNA转化技术的应用提供新的思路。

中华绒螯蟹DNA指纹图谱的初步研究

本文运用 DIG标记的人源小卫星探针 33.6与 HaeⅢ消化的中华绒螯蟹基因组 DNA杂交，建立了中华绒螯蟹非放射性 DNA指纹图谱，证明目前在缺乏来自中华绒螯蟹基因组 DNA本身的同源小卫星 DNA的情况下，运用异源小卫星探针进行中华绒螯蟹 DNA指纹图谱的研究是可行的；实验表明运用人源小卫星探针 33.6进行中华绒螯蟹 DNA指纹图谱研究时，该探针可检测到 10个以上位点的遗传变异，每个位点呈现丰富的多态性。

枯草芽孢杆菌基因组DNA对中华绒螯蟹非特异性免疫因子的影响

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtzlis)基因组DNA按5、20和80μg/kg剂量体腔注射中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)(约0.1 mL/只),设注射等体积TE缓冲液为对照组,分别在第1、3、5、7天采样,测定该细菌DNA对中华绒螯蟹的免疫刺激作用。结果显示:注射上述3种剂量的枯草芽孢杆菌基因组DNA均能不同程度地提高中华绒螯蟹的THC、血细胞呼吸爆发活性和血清PO、ACP活性,试验组蟹的上述免疫指标的活性显著高于对照组(P<0.05),并以20μg/kg体重剂量的刺激效果最好;但试验剂量的细菌DNA对血清ALP活性无显著影响(P>0.05)。

黄河口中华绒螯蟹成蟹形态性状与体质量的相关性及通径分析

为确定影响黄河口地区养殖中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)成蟹体质量的重要形态性状,为品种选育提供参考,测定随机采集的247只黄河口中华绒螯蟹成蟹的头胸甲长(X1)、头胸甲宽(X2)、体高(X3)、第三步足长节长(X4)和体质量(Y),通过相关分析、多元回归分析及通径分析建立其形态性状与体质量间的多元线性回归方程。研究显示各形态性状与体质量的相关程度均达到极显著水平(P<0.01)。通过回归分析,剔除偏回归系数不显著的性状,排除共线性自变量,建立了最优多元线性回归方程Y=-328.06+5.43X2+2.43X4。拟合度检验表明达到极显著水平(P<0.01)。通径分析结果显示,头胸甲宽对体质量的直接影响最大,直接作用大于间接作用,表明头胸甲宽是影响黄河口中华绒螯蟹成蟹体质量的主要性状。在对黄河口中华绒螯蟹成蟹以体质量为目标性状进行选育时,可以头胸甲宽(X2)为主要间接选择指标,第三步足长节长(X4)为辅进行选育。

V_C对河蟹血清和组织中超氧化物歧化酶及磷酸酶活性的影响

研究了饲料中添加不同含量VC 对河蟹体内超氧化物歧化酶 (SOD)、碱性磷酸酶 (ALP)和酸性磷酸酶 (ACP)活性的影响 .结果表明 ,饲料中不添加VC 时 ,河蟹肝胰腺、卵巢、血清和肌肉各组织中SOD、ALP和ACP活性各异 ,其中SOD活性大小顺序为肝胰腺 >卵巢 >血清 >肌肉 ,ALP活性顺序为肝胰腺 >血清 >卵巢 >肌肉 ,而ACP活性则为肝胰腺 >血清 >肌肉 >卵巢 .饲料中VC 添加量分别 2 .5× 1 0 - 3 、5.0×1 0 - 3 、1 0 .0× 1 0 - 3 和 1 5.0× 1 0 - 3 (m m)时 ,与对照组相比 ,河蟹不同组织中SOD活性显著下降 (p <0 .0 5或 p <0 .0 1 ) ,而ALP、ACP这两种酶的活性却显著升高 (p <0 .0 5或 p <0 .0 1 ) .但它们的变化幅度不同 ,其中就肝胰腺、卵巢、血清和肌肉中SOD活性而言 ,VC 添加量为 1 5.0× 1 0 - 3 (m m )饲料组分别比对照组的低1 41 .3 4 %、1 2 5.94%、1 1 6.67%和 1 1 5.79%;ALP活性 ,VC 添加量为 1 0 .0× 1 0 - 3(m m)饲料组分别比对照组高 93 .0 %、77.5%、1 66.3 %和 2 66.4%;ACP活性 ,VC的添加量为 1 5.0× 1 0 - 3 (m m)饲料组分别比对照组高 1 3 0 .7%、2 3 7.4%、43 7.6%和 2 65.5%.饲料中VC 添加量为 (5.0～ 1 0 .0 )× 1 0 - 3 (m m )时 ,可有效地增强河蟹非特异性免疫能力 .此外 。

基于主成分分析和聚类分析评价中华绒螯蟹蟹肉香气品质的研究

运用顶空固相微萃取-气-质联用技术,对采自阳澄湖的特级、1级、2级的雌性中华绒螯蟹体肉、钳肉和足肉中的香气成分进行了鉴定并以内标法对其定量。通过主成分分析法(PCA)和聚类分析法(CA)对不同蟹肉样品的香气品质进行评价。主成分分析结果显示:不同等级中华绒螯蟹钳肉和足肉的综合得分均大于零(2级-钳肉除外),香气品质较好,醇类、酮类、呋喃类、含氮类和芳香类五类成分对其贡献显著,是表征"高品质风味"的特征性香气成分;将部位因素统一考虑后,大闸蟹等级越高,蟹肉香气品质越好;将等级因素统一考虑后,大闸蟹足肉香气品质最佳,钳肉次之,体肉最差。经聚类分析发现:不同等级大闸蟹体肉及足肉样品香气轮廓可各自聚为一类。醇类、呋喃类、酮类、含氮类和芳香类5类香气成分可聚为一类。主成分分析和聚类分析结果存在一致性且可以相互补充,今后可利用两种方法建立不同大闸蟹蟹肉香气品质的评价模型。

磺胺甲基异噁唑在中华绒螯蟹体内的代谢和消除规律

在水温25℃，以100mg/kg蟹体重的磺胺甲基异噁唑（SMZ）对中华绒螯蟹单次口灌给药，采用RP—HPLE方法研究了SMZ在中华绒螯蟹体内的代谢和消除规律。给药后0．5～3h，SMZ在血淋巴和肝胰腺中的浓度迅速上升，至第3小时达到峰值（15．466±1．499）μg／mL和（13．491±1．315）μg／g；而肌肉和性腺（卵巢和精巢）中SMZ却上升较慢，第3小时仅为（5．955±0．354）μg,／g、（6．950±0．240）μg／g、（7．015±0．356）μg/g，第6小时才达到峰值（6．232±0．325）μg／g、（7．551±0．255）μg／g、（8．055±0．274）μg/g，峰值仅为血淋巴和肝胰腺的1／2左右。SMZ在中华绒螯蟹性腺和肝胰腺中消除速度均较慢，但肌肉比肝胰腺稍快。给药后第10天，肌肉和卵巢中SMZ降至为（0．051±0．014）μg／g和（0．099±0．003）μg／g，而肝脏和精巢中SMZ尚在0．1μg／g以上，为（0．483±0．042）μg／g和（0．123±0．006）μg／g。给药后第20天，仅肝胰腺中可检测到SMZ，为0．090μg/g左右。肌肉、肝胰腺和性腺（卵巢和精巢）SMZ浓度-时间消除曲线方程分别为C0=18．537e^-0．224t＋4.0775e^-0.018t、C0=9．823e^-0.021t＋1．898e^-0.006t、C0=4．405e^0.039t＋3．894e^-0.017t、C0=5．707e^-0.033t＋2．478e^-0.013t，各组织中T1/2β分别为1．6d,4．74d、1．7d和2．2d。若要使SMZ在中华绒螯蟹肌肉、肝胰腺和性腺中的浓度降至0．1μg／g以下，则休药期分别需13．473d、24．61d、10．33d和14．52d。试验表明，SMZ在中华绒螯蟹组织中消除较缓慢，尤其在肝胰腺中，因此肝胰腺可以作为SMZ残留监测的首选组织。

维生素E对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)酚氧化酶、抗菌力和溶菌酶活性的影响

在以鱼粉、豆粕、玉米粉和麦麸为主要原料配制而成的每kg基础饲料中分别添加VE0、100、200、400、600mg配制成五种试验饲料,对均重为(37.52±2.19)g的中华绒螯蟹进行为期60天的饲养试验,以酚氧化酶(PO)、抗菌力(Ua)、溶菌酶活性(UL)等指标为依据,探讨VE对中华绒螯蟹非特异性免疫的影响。结果表明,VE对中华绒螯蟹各组织、器官中PO、Ua、UL等活性有显著或极显著的影响(P<0.05或P<0.01),在适宜范围内,随着VE添加量的增加,PO、Ua和UL活性显著增强,从而增强中华绒螯蟹的非特异性免疫力。综上所述,VE作为免疫刺激剂能有效地增强中华绒螯蟹的非特异性免疫能力,增强中华绒螯蟹免疫功能的VE适宜添加量为200—400mg/kg饲料。

中华绒螯蟹不同部位中活性香气物质的研究

运用顶空固相微萃取-气-质联用技术(HS-SPME-GC-MS),对采自崇明的二级雄性中华绒螯蟹体肉、钳肉、足肉和性腺中的香气成分进行了鉴定并以内标法对其定量。大闸蟹四可食部位中共检测到8大类58种香气物质,根据阈值进一步求得每种香气物质的活性值(OAV值)。以OAV值为依据,从58种化合物中筛选得到了癸醛等15种最为关键的活性香气物质,并运用主成分分析法(PCA)和聚类分析法(CA)对其活性值进行了分析。由PCA分析得到:性腺样品香气品质较佳,戊醛等8种为表征"高品质风味"的特征性香气物质(其中2,4-庚二烯醛最为重要)。由CA分析得到:大闸蟹性腺样品可聚为一类,戊醛等8种活性香气成分也可聚为一类。主成分分析和聚类分析结果存在一致性且可以相互补充,今后可利用两种方法建立大闸蟹香气品质的评价模型。

V_E对河蟹血清和组织中超氧化物歧化酶及磷酸酶活性的影响

通过投喂添加VE 量分别为 0、0 .1× 1 0 - 3 、0 .2× 1 0 - 3 、0 .4× 1 0 - 3 、0 .6× 1 0 - 3(m m)的 5种实验饲料饲养河蟹 6 0d ,以探讨VE 对其体内SOD、ALP和ACP等酶活性的影响 .结果表明 ,饲料中未添加VE 时 ,河蟹血清、肝胰腺、卵巢和肌肉各组织中SOD、ALP和ACP活性各异 ,其中SOD的活性从高到低依次为肝胰腺 >卵巢 >血清 >肌肉 ,ALP活性的为肝胰腺 >血清 >卵巢 >肌肉 ,而ACP活性则是肝胰腺 >血清 >肌肉 >卵巢 .饲料中添加VE 时 ,与对照组相比 ,各组织中SOD活性随着VE添加量的升高而显著降低 ( p <0 .0 5或 p <0 .0 1 ) ;ALP和ACP活性则随着VE 添加量的增加而显著升高 ( p <0 .0 5或 p <0 .0 1 ) .这表明VE 作为天然抗氧化剂在河蟹体内发挥了很大的作用 ,并促进机体的新陈代谢 ,从而增强机体的非特异性免疫力 .VE 作为免疫刺激剂能有效地增强河蟹的非特异性免疫能力 ,能有效发挥其增强河蟹免疫功能的VE 适宜添加量为 ( 0 .2～ 0 .4)× 1 0 - 3(m m) .

中华绒螯蟹蟹种配饵中豆饼替代部分鱼粉的适宜含量

本试验以不同比例的豆饼、鱼粉为主要蛋白源，配以菜饼、麸皮、玉米粉、复合维生素和无机盐等组成五组精制饵料，配饵的蛋白质含量为３６．６４～３７．２３％，脂肪２．７５～３．１０％，动、植物蛋白比１：０．１３～２．４３，每公斤饵料合总能４５１．５１～４６２．２３千卡。在室内水泥．池中用上述配饵时规格约５克的蟹种进行精心喂养４０天，试验期间水温控制在２４±１℃，试验结束时，以饵料的必需氨基酸组成、河蟹的特定生长率、饵料蛋白质利用率、蟹体生化组成等作为评价指标，结果表明，蟹种实用配饵中用３０％左右的豆饼替代鱼粉是合适的。豆饼添加过量或不足均会造成配饵中某些必需氨基酸比例失调而降低蟹的生长速度。

中华绒螯蟹颤抖病的人工复制试验

用在江苏采集的发生“颤抖病”的中华绒螯蟹 (BY0 )组织匀浆 ,经除菌处理 ,人工接种健康绒螯蟹 ,约 10d发病 ,出现典型症状 ,继而死亡。将人工复制发病的绒螯蟹 (BY1)除菌后 ,接种健康绒螯蟹 ,同样使其发病并死亡(BY2 )。电镜观察BY0、BY1、BY2的超薄切片 ,其神经组织和肝胰脏等的细胞质中发现圆形病毒颗粒 ,大小约 5 5～ 6 5nm ,具有外膜样结构。因此 ,可以认为中华绒螯蟹颤抖病的病原为病毒。

中华绒螯蟹消化道组织学及扫描电镜研究

对中华绒螯蟹成蟹消化道各段进行了光镜组织学结构的观察 ;应用扫描电镜技术 ,观察了中华绒螯蟹消化道各段黏膜上皮表面超微结构特征。结果表明 :除中肠及后盲囊外 ,整个消化道黏膜上皮表面均有较厚的分泌物层和较发达的纤毛层。纤毛形态结构各异 ;以食道和后肠分布最密 ,胃和肠球次之。消化道各段黏膜上皮细胞表面均形成大小不一、形态各异的多级皱褶和嵴。仅中肠表面具典型微绒毛结构。各消化道段黏膜上皮表面均未见杯状细胞 ,上皮下基膜发达 ,黏膜下层明显 ,消化腺分布其间。整个消化道壁的肌层均为横纹肌 ,且排列疏松 ,外膜多为浆膜。

配饵中大豆浓缩蛋白不同含量对中华绒螯蟹氮、磷排泄的影响

以鱼粉和大豆浓缩蛋白(SPC)为主要饵料蛋白源,配制了大豆浓缩蛋白水平分别为0%、11%、22%、33%、44%、56%的系列饵料,替代鱼粉的比例分别为0%、18.64%、37.93%、56.89%、77.19和100%。经70d投喂,测定中华绒螯蟹氨氮和活性磷酸盐排泄率。结果表明,当SPC替代鱼粉的比例为0%～56.89%时,中华绒螯蟹的氨氮排泄率虽有所升高,但没有显著差异(P>0.05);SPC的替代比例超过56.89%时,中华绒螯蟹的氨氮排泄率则显著性升高(P<0.05);SPC替代鱼粉的比例与中华绒螯蟹氨氮排泄率的相关方程为y=0.1197x+0.168(R2=0.8131)。SPC替代鱼粉的比例与中华绒螯蟹活性磷酸盐排泄率成显著负相关,方程为y=-0.0739x+0.6246(R2=0.9489)。

不同增养殖水体中华绒螯蟹肌体矿物元素比较分析

对不同增养殖水体中华绒螯蟹可食部分主要矿物元素等指标进行分析研究,结果表明:中华绒螯蟹可食部分含9种以上矿物元素,雄蟹矿物元素中平均值以钙含量最高,雌蟹矿物元素平均值以磷含量最高。中华绒螯蟹钾的含量明显高于钠。比较不同增养殖水体雄蟹常量元素含量,固城湖放流与长江野生蟹无显著差异(P>0.05),均较其它水体雄蟹高,雌蟹常量元素太湖网围与长江野生无显著差别(P>0.05),含量都较高,尤以太湖网围常量元素含量为最高。雄蟹、雌蟹微量元素呈现相同规律:铁、锰以金坛池塘、固城湖放流含量较高。铜含量以长江野生为最高。锌含量各水体无显著差别。

两种肝胰腺色泽中华绒螯蟹营养品质比较

将辽河水系中华绒螯蟹Eriocheir sinensis扣蟹饲养在10.4 m×7.6 m×1.2 m、前期为伊乐藻Elodea nuttallii,后期搭配喜旱莲子草Alternanthera philoxeroides和苦草Vallisneria natans的3口池塘中,密度约为1.2只/m2。经7个月左右的常规养殖后,雌、雄体平均体质量分别为(97.03±6.91)g和(153.79±6.98)g,采集肝胰腺偏黑色泽(河蟹Ⅰ)和正常色泽(河蟹Ⅱ)的河蟹样品共24只(雌雄各半),活体解剖,测定总可食率(TEY)、常规营养成分含量和脂肪酸组成。结果显示:河蟹Ⅰ和河蟹Ⅱ雌体TEY存在极显著差异(P<0.01),雄体出肉率(MY)和TEY存在显著性差异(P<0.05),其余指标无显著性差异(P>0.05)。除雌体肥满度(CF)相同外,河蟹Ⅱ各项数值均要高于河蟹Ⅰ。雌体肝胰腺中总脂、肌肉中粗蛋白和总脂含量存在极显著差异(P<0.01);肝胰腺中水分,性腺中粗蛋白含量存在显著性差异(P<0.05)。雄体肌肉中粗蛋白含量存在极显著差异(P<0.01);肝胰腺中水分、粗蛋白、总脂,性腺中粗蛋白含量存在显著性差异(P<0.05)。肝胰腺中脂肪酸差异项占总参数的比例为23/52,超过40%参数存在显著性差异(P<0.05),而在性腺和肌肉中此比例仅为10%和15%左右。综上所述,两组河蟹总可食率、可食组织中总脂和蛋白含量、肝胰腺中超过40%的脂肪酸参数存在显著性差异(P<0.05),而肥满度、肌肉和性腺中脂肪酸差异不显著(P>0.05),两组河蟹营养价值均较高。